Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,775

EXPERIMENTAL MODELING AND STIMULATION OF INTRA-ARTICULAR INJURY HEALING IN RATS

Silanteva T.A. 1 Krasnov V.V. 1 Kubrak N.V. 1
1 FSBI RISC «RTO» of the RF Ministry of Health
3864 KB
A technique for producing an acetabular linear perforating osteochondral injury in small laboratory animals (rats) developed with the possibility of graduated injections of biologically active agents into the zone of injury (RF Patent No 2470378). The mechanisms of osteoinduction influencing the composition of homologous blood plasma, ascorbic acid and glucose solutions for their combined intraarticular injections in the early posttraumatic period studied using the proposed experimental model (RF Patent No 2463986). Daily single injections of the mentioned composition established to accelerate the completion of the inflammatory stage of reparative process and filling the diastasis with vascularized granulation tissue. Ki-67 proliferation marker expression in bone marrow stromal mechanocytes, periosteal osteoblasts, perivasculocytes of the intermediary zone of union evidences of reparative osteogenesis activation.
experimental model
acetabulum
intraarticular injury
blood plasma
reparative osteogenesis

Несмотря на внедрение новых хирургических технологий лечения пациентов с повреждениями крупных суставов, число неблагоприятных исходов ежегодно увеличивается, что указывает на необходимость поиска новых подходов и парадигм [8]. Установлено, что, синовиальная жидкость оказывает ингибирующее влияние на заживление внутрисуставного перелома [5]. Являясь фильтратом плазмы крови, она включает дополнительные компоненты, замедляющие процесс репаративного остеогенеза и характеризуется высоким, по сравнению с плазмой крови, содержанием аскорбиновой кислоты [9, 10]. После травмы концентрации компонентов системы антиоксидантной защиты аскорбата и супероксиддистмутазы (СОД) в синовиальной жидкости значительно снижаются [7]. Излившаяся кровь является дополнительным негативным фактором для заживления перелома, так как разрушение эритроцитов в условиях гипоксии приводит к накоплению избытка ионов железа, что на фоне сниженной активности СОД усугубляет тяжесть вторичного посттравматического повреждения тканей [2].

С учетом перечисленных патогенетических факторов, предложен способ нейтрализации и удаления цитотоксических соединений из полости сустава путем капельного дренирования композицией лекарственных веществ, включающей аутологичную плазму крови в сочетании с официнальными растворами аскорбиновой кислоты и глюкозы (патент РФ № 2463986). Применение данной методики на собаках позволило добиться формирования костного сращения уже на 14 сутки после моделирования перелома вертлужной впадины, в три раза сократив период консолидации и снизив при этом выраженность дегенеративных изменений в суставном хряще [3, 4]. Однако в данном эксперименте не были изучены ранние сроки заживления перелома, что не позволило судить о механизмах феномена. Для продолжения исследований, по нашему мнению, целесообразна адаптация модели внутрисуставного повреждения для мелких лабораторных животных, что согласуется с концепцией альтернативных подходов в экспериментальной биологии и медицине [1].

Целью настоящей работы являлось тестирование биологической активности композиции на основе плазмы крови, аскорбиновой кислоты и глюкозы при дозированном внутрисуставном введении на модели линейного сквозного костно-хрящевого повреждения вертлужной впадины крыс в раннем посттравматическом периоде.

Материалы и методы исследования

Экспериментальное исследование проведено на 20 крысах Вистар обоего пола в возрасте 10 месяцев, массой тела от 250 до 350 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Оперативные вмешательства и эвтаназия осуществлялись в соответствии требованиями Минздрава России к работе экспериментально-биологических клиник, а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» и были одобрены этическим комитетом ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова».

Получение модели линейного сквозного костно-хрящевого повреждения вертлужной впадины (патент РФ № 2470378) выполняли в стерильных условиях под общим комбинированным наркозом: золетил 100 («Virbac Sante Animale», Франция) 8 мг/кг, ксилазин 2 % («Alfasan International B.V.», Голландия) 4.0 мг/кг, внутримышечно. В области шейки бедренной кости вскрывали капсулу сустава и производили вывих головки из вертлужной впадины. Далее с помощью хирургической пилы толщиной 0,2 мм производили поперечный пропил вертлужной впадины со стороны ее дорсальной части до уровня середины суставной ямки, после чего выполняли резекцию головки и шейки бедренной кости [8]. Через операционную рану в суставную полость устанавливали мягкий катетер диаметром 0,6 мм Перификс («B. Braun», Германия) и ушивали капсулу сустава нитью из полипропилена 3/0 (рис. 1, а). Операцию завершали выполнением контрольной рентгенографии (рис. 1, б).

Со 2 по 5 сутки после операции в полость сустава ежедневно, однократно вводили 0,2 мл растворов лекарственных веществ (рис. 1, в). Животным контрольной группы (n = 10) инъецировали 0,9 % раствор натрия хлорида. В опытной группе (n = 10) выполняли инъекции композиции, состоящей из гомологичной плазмы крови, официнальных растворов 5 % аскорбиновой кислоты и 40 % глюкозы, взятых в объемном соотношении 7:2:1 (патент РФ № 2463986). Кровь для получения плазмы забирали у интактных животных, используя вакуумные системы с гепарином. Плазму отделяли центрифугированием в лабораторной центрифуге «ОПн-3М» («Дастан», Кыргызстан) при 1000 об/мин в течение 10 мин. Аликвоты плазмы крови объемом 1 мл помещали в пластиковые пробирки с крышками типа Eppendorf и замораживали при – 20 °С. Перед выполнением инъекций плазму размораживали при 37 °С. Для стерилизации растворов использовали бактериальный фильтр Перификс 0,2 µ («B. Braun», Германия).

sil1a.tif sil1b.tif

а б

sil1c.tif sil1d.tif

в г

Рис. 1. Моделирование повреждения вертлужной впадины крысы: вид операционной раны (а); рентгенограмма пояса тазовых конечностей после операции, дорсо-вентральная проекция (б); внутрисуставное введение композиции лекарственных веществ через коннектор (в); рентгенограмма макропрепарата оперированной вертлужной впадины, латеральная проекция (г)

sil2a.tif sil2b.tif

а б

sil2c.tif sil2d.tif

в г

Рис. 2. Влияние остеоиндуцирующей композиции на гистоструктуру вертлужной впадины крыс в области моделирования повреждения: заполнение диастаза между раневыми поверхностями кости детритом с лейкоциарной инфильтрацией в контроле (а) и грануляционной тканью – в опыте (б); Ki-67-негативное окрашивание костного мозга в контроле (в) и выявление Ki-67-позитивных стромальных механоцитов (указаны стрелками) в костном мозге животных опытной группы (г). Срок эксперимента – 5 суток. Парафиновые срезы. Окраска гематоксилином и эозином, ×400 (а, б). Иммуногистохимическое определение экспрессии Ki-67 (коричневое окрашивание) с докраской гематоксилином, ×400 (в, г)

sil3.wmf

Рис. 3. Влияние остеоиндуцирующей композиции на клеточный состав зоны внутрисуставного повреждения вертлужной впадины крыс через 5 суток эксперимента

 

По истечении 5 суток после операции, животных эвтаназировали передозировкой тиопентала натрия («Синтез», Россия,) 45 мг/кг, внутривенно. Поврежденную суставную впадину вычленяли и выполняли контрольную рентгенографию (рис. 1, г).

Полученный костный блок освобождали от пароссальных тканей и помещали на 3 суток в смесь 2 % растворов глутарового и параформальдегидов на фосфатном буфере (рН 7,4). Затем образцы обезжиривали в ацетоне, декальцинировали в 10 % растворе Трилона Б (рН 7,4) и заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Экспрессию маркера пролиферативной активности клеток Ki-67 определяли с использованием набора реактивов для иммуногистохимии и системы визуализации RE7140-К («Novocastra», Великобритания).

Исследование гистологических препаратов производили с использованием стереомикроскопа AxioScope.A1 и цифровой камеры AxioCam ICc 5 в комплекте с программным обеспечением Zen blue («Carl Zeiss MicroImaging GmbH», Германия). При микроскопировании с объективом 100× для масляной иммерсии оценивали клеточную плотность в 1 мм2 площади среза для категорий «клеточный детрит» «общая клеточная плотность», «фибробластоподобные клетки», «сегментоядерные лейкоциты», «мононуклеарные фагоциты», «полинуклеарные фагоциты», «эндотелиоциты». Измерения выполняли в 10 полях зрения для каждого экспериментального случая, при этом подсчитывали не менее 300 клеток. Значения митотического индекса фибробластоподобных клеток выражали в промилле ( ‰). Для статистического анализа данных использована программа AtteStat, версия 13.1 (свидетельство № 2002611109). Результаты приведены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M ± m). Межгрупповые отличия оценивали с применением непарного t-критерия Стьюдента для независимых выборок.

Результаты исследования и их обсуждение

При исследовании зоны перелома вертлужной впадины у животных контрольной группы было установлено, что диастаз между отломками был заполнен фибрином и тканевым детритом, включающим поля некротически измененных клеток с выраженным криопикнозом, кариорексисом либо кариолизисом. В клеточном составе преобладали сегментоядерные лейкоциты и мононуклеарные фагоциты, характерные для воспалительной стадии репаративного процесса, а также встречались немногочисленные лимфоциты (рис. 2, а).

О начале пролиферативной стадии репарации свидетельствовало присутствие фибробластоподобных веретеновидных клеток с крупным базофильным ядром, содержащим 1–2 ядрышка. Индекс их митотической активности был чрезвычайно высоким, составляя 26,8 ‰. В костном веществе вертлужной впадины на протяжении 0,5–2 мм от линии повреждения наблюдали пустые костные лакуны и безъядерные остеоциты, лейкоцитарную инфильтрацию костного мозга (рис. 2, в).

У животных опытной группы диастаз заполняла грануляционная ткань с большим количеством тонкостенных капилляров, выстланных изнутри уплощенными ядросодержащими клетками – эндотелиоцитами. В ее составе преобладали веретеновидные или слабоотросчатые фибробласты, отличающиеся эксцентрично расположенным базофильным эухроматиновым ядром с 1–2 ядрышками и слабо базофильной цитоплазмой. Индекс их митотической активности составлял 2,5 ‰. Также обнаруживались мононуклеарные фагоциты – моноциты и макрофаги. На поверхности травмированных костных трабекул располагались активные остеобласты, встречались немногочисленные остеокласты (рис. 2, б). В костной ткани отломков вблизи линии повреждения определялись ядросодержащие остеоциты, на периостальной и эндостальной поверхности – активные остеобласты.

Иммуногистохимический анализ в контрольной группе показал, что Ki-67-позитивными являлись лишь единичные фибробластоподобные клетки зоны сращения. В опытной группе экспрессия маркера обнаруживалась в отросчатых стромальных механоцитах костного мозга, периостальных остеобластах и периваскулярных клетках грануляционной ткани (рис. 2, в, г). Большая часть метки распределялась в ядре, однако цитоплазма клеток также была слабопозитивной.

Сравнительное морфометрическое исследование клеточного состава зоны сращения отломков выявило статистически значимые межгрупповые отличия по каждому из параметров (р < 0,001) (рис. 3).

В контрольной группе численная плотность некротизированных клеток в 1 мм2 площади среза составила 2407 ± 144,4; общая плотность жизнеспособных ядросодержащих клеток – 1091 ± 48,8; фибробластоподобных клеток – 118 ± 17,0; сегментоядерных лейкоцитов – 453 ± 31,1; мононуклеарных фагоцитов – 520 ± 36,5; полинуклеарные фагоциты и эндотелиоциты не определялись. В опытной группе соответствующие значения параметров равнялись 521 ± 18,2; 3790 ± 71,7; 1898 ± 63,2; 160 ± 15,5; 973 ± 31,0; 101 ± 10,2; 657 ± 27,6. Под влиянием внутрисуставных инъекции тестируемой композиции лекарственных веществ численность некротизированных клеток и сегментоядерных лейкоцитов снижалась в 4,5 и 2,8 раза соответственно. Вместе с тем отмечалось более чем трехкратное увеличение численной плотности жизнеспособных ядросодержащих клеток, в том числе фибробластов – в 16 раз и мононуклеарных фагоцитов – в 1,9 раза

Заключение

Таким образом, проведенное исследование показало пригодность разработанной модели сквозного линейного костно-хрящевого повреждения вертлужной впадины мелких лабораторных животных для тестирования биологически активных веществ при их интраартикулярном введении. Полученные результаты позволили раскрыть механизмы, лежащие в основе стимулирующего влияния гомологичной плазмы крови в сочетании с официнальными растворами аскорбиновой кислоты и глюкозы. Выполнение ежедневных однократных внутрисуставных инъекций указанной композиции в остром посттравматическом периоде ускоряет завершение воспалительной стадии репаративного процесса и заполнение диастаза васкуляризированной грануляционной тканью. Выявление экспрессии маркера пролиферации Ki-67 в стромальных механоцитах костного мозга отломков, периостальных остеобластах и периваскулоцитах зоны повреждения свидетельствует об активизации процесса репаративного остеогенеза.