Исследование свойств глюкоамилаз различного происхождения приобретает особую значимость в связи с применением их в различных отраслях промышленности в роли биокатализаторов. Поиск путей регулирования биокаталитической активности ферментов неразрывно связан с расшифровкой закономерностей и молекулярного механизма катализа реакции гидролиза субстрата. Для решения данной задачи, наряду с определением функциональных свойств энзимов, необходимо проведение их структурного анализа.
Для выявления константных областей аминокислотных последовательностей ферментов с помощью программы Gene Bee (http://www.genebee.msu.ru/genebee.html) осуществлено сравнение сиквенсов субъединицы глюкоамилазы из Aspergillus awamori X100 и молекулы глюкоамилазы из Saccharomyces cerevisiae, размещенных в INTERNET National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/Entrez) и Protein Brookhaven Database (http://www.rcsb.org/).
Сравнительный анализ первичных структур глюкоамилаз из Asp. awamori и S. cerevisiae показал их гомологичность на 13,1%. Наиболее часто на протяжении рассматриваемых полипептидных цепей наблюдаются корреляции одиночных гомологичных остатков; встречаемость гомологичных дуплетов и триплетов гораздо ниже (табл. 1).
Таблица 1
Частота встречаемости гомологичных аминокислотных остатков
в первичных структурах глюкоамилаз из Aspergillus awamori и Saccharomyces cerevisiae
|
Аминокислота |
Частота встречаемости |
Аминокислота |
Частота встречаемости |
|
аланин |
11 |
триптофан |
4 |
|
валин |
8 |
аспарагин |
- |
|
лейцин |
4 |
глутамин |
2 |
|
изолейцин |
- |
серин |
47 |
|
глицин |
5 |
треонин |
36 |
|
пролин |
12 |
лизин |
1 |
|
цистеин |
2 |
аргинин |
- |
|
метионин |
- |
гистидин |
- |
|
аспарагиновая кислота |
8 |
глутаминовая кислота |
7 |
|
фенилаланин |
- |
тирозин |
2 |
Из табл. 1 видно, что основное количество гомологичных звеньев представлено остатками Ser и Thr. Данные аминокислоты являются гидроксилсодержащими и ответственны за активное взаимодействие белковой макромолекулы с молекулами воды, обеспечивая хорошую растворимость фермента. Кроме того, Ser и Thr способны к образованию эфиров фосфорной и органических кислот и служат местом присоединения углеводных компонентов в гликопротеидах [1, 3].
Наличие значительного числа гомологичных остатков Asp и Glu, а также Trp позволяет предположить участие данных аминокислот в катализе реакции гидролиза крахмала, осуществляемом глюкоамилазами как плесневого, так и дрожжевого происхождения [1, 3].
В табл. 2 представлен полный аминокислотный состав глюкоамилаз из Asp. awamori и S. cerevisiae. Анализ аминокислотного состава глюкоамилаз различного происхождения показал высокую устойчивость фермента из Asp. awamori к органическим растворителям, одна субъединица которого содержит 27,15% остатков с алкильными боковыми цепями (Ala, Val, Leu, Ile, Met); для молекулы глюкоамилазы из S. cerevisiae данная величина составляет лишь 17,65%. Большое количество остатков Ser и Thr (для субъединицы молекулы глюкоамилазы из Asp. awamori 14% и 12% соответственно, для целой молекулы из S. cerevisiae - 25,7% и 25,32%) обеспечивает гилратацию белковой глобулы вследствие образования системы водородных связей.
Таблица 2
Аминокислотный состав глюкоамилаз из Aspergillus awamori и Saccharomyces cerevisiae
|
Аминокислота |
Aspergillus awamori (субъединица) |
Saccharomyces cerevisiae |
||
|
количество |
% от общего числа |
количество |
% от общего числа |
|
|
аланин |
59 |
9,59 |
85 |
6,33 |
|
валин |
39 |
6,34 |
94 |
7 |
|
лейцин |
43 |
7 |
22 |
1,64 |
|
изолейцин |
25 |
4,07 |
32 |
2,38 |
|
глицин |
47 |
7,64 |
43 |
3,2 |
|
пролин |
24 |
3,9 |
141 |
10,5 |
|
цистеин |
9 |
1,46 |
20 |
1,49 |
|
метионин |
1 |
0,16 |
4 |
0,3 |
|
гистидин |
5 |
0,81 |
5 |
0,37 |
|
фенилаланин |
21 |
3,41 |
14 |
1,04 |
|
тирозин |
27 |
4,39 |
22 |
1,64 |
|
триптофан |
19 |
3,09 |
8 |
0,6 |
|
аспарагин |
21 |
3,41 |
35 |
2,61 |
|
глутамин |
17 |
2,76 |
19 |
1,41 |
|
серин |
86 |
13,98 |
345 |
25,69 |
|
треонин |
73 |
11,87 |
340 |
25,32 |
|
лизин |
12 |
1,95 |
30 |
2,23 |
|
аргинин |
18 |
2,93 |
1 |
0,07 |
|
аспарагиновая кислота |
44 |
7,15 |
14 |
1,04 |
|
глутаминовая |
25 |
4,07 |
69 |
5,14 |
|
Общее число |
615 |
1343 |
||
Из табл. 2 видно, что в состав субъединицы молекулы глюкоамилазы из Asp. awamori входят 9 остатков цистеина, SH-группы которых образуют 3 дисульфидных мостика и свободную тиольную группу в каталитическом домене и 1 S-S связь в крахмалсвязывающем участке. В молекуле энзима из S. cerevisiae имеется 20 Cys (по 10 на каждую субъединицу). Однако, возможно не все остатки Cys участвуют в образовании дисульфидных связей. Вероятно, число S-S мостиков в расчете на одну субъединицу составляет не более трех [2, 4-6].
Обнаружено, что количество остатков Asp, Glu в молекуле глюкоамилазы из Asp. awamori в 4 раза превышает данную величину для фермента дрожжевого происхождения.
Таким образом, в ходе проведенных исследований установлена гомологичность первичных структур глюкоамилаз из Asp. awamori и S. cerevisiae на ~13%. Обнаружена высокая степень корреляции одиночных аминокислотных остатков. Выявлено, что основное количество гомологичных звеньев представлено остатками Ser и Thr, обеспечивающих хорошую гидратацию ферментов и служащих местами присоединения углеводных компонентов в гликопротеидах. Наличие значительного числа гомологичных остатков Asp и Glu, а также Trp позволяет предположить участие данных аминокислот в катализе реакции гидролиза крахмала, осуществляемом глюкоамилазами как плесневого, так и дрожжевого происхождения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
- Галич И.П. Амилазы микроорганизмов. Киев: Наук. думка, 1987. 192 с.
- Кантор Ч. Биофизическая химия. М.: Мир, 1984. Т. 1. 336 с.
- Квеситадзе Г.И. Грибные и бактериальные амилазы. Тбилиси: Мецниереба, 1984. 154 с.
- Попов Е.М. Структурно-функцио-нальная организация белков. М.: Наука, 1992. 358 с.
- Шерман С.А. Конформационный анализ и установление пространственной структуры белковых молекул. Минск: Наука и техника, 1989. 240 с.
- Шульц Г. Принципы структурной организации белков. М.: Мир, 1982. 360 с.