В настоящее время известно, что короткие пептиды являются сигнальными молекулами, которые участвуют в регуляции гомеостаза на различных уровнях организации живой материи и являются частью сложнейшей системы специализированных молекул-сигнализаторов и переносчиков информации между клетками организма [2, 9]. К коротким регуляторным пептидам можно отнести трипептид Gly-His-Lys, для которого известны модулирующее влияние на рост и дифференцировку клеток [14], процессы ранозаживления за счет стимуляции синтеза коллагена фибробластами [11], физиологическую и репаративную регенерацию печени [8], стимулирующее влияние пептида на рост волос [15] и противовоспалительный эффект в поврежденных тканях [10]. Однако в литературе отсутствуют данные об исследовании нейротропных эффектов данного пептида. При этом вышеуказанная полифункциональность пептида и данные литературы о механизмах влияния коротких регуляторных пептидов на функции нервной системы [9] позволяют предполагать наличие подобных эффектов и у данного трипептида.
Одним из наиболее распространенных методов изучения поведения животных является тест «открытое поле», который позволяет в новых (стрессогенных) условиях оценить ориентировочно-исследовательские и защитно-оборонительные поведенческие реакции. Поэтому целью данного исследования являлось изучение влияния трипептида Gly-His-Lys на поведение крыс в тесте «открытое поле».
Материалы и методы исследования
Эксперименты выполнены на 40 крысах-самцах Вистар массой 180-220 г., полученных из питомника РАМН «Столбовая». Животных содержали в клетках по 10 особей в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище при 12-часовом световом режиме и контролируемой температуре (22±2 °С). Все процедуры с животными выполняли в соответствии с международными правилами и нормами (European Communities Council Directives of 24 November1986, 86/609/EEC).
В работе использовали пептид Gly-His-Lys синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета. Пептид растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно за 12 мин до начала опыта в дозах 0,5; 5 и 50 мкг/кг. Контрольным животным вводили эквивалентные объёмы физиологического раствора из расчёта 1 мл на 1 кг массы.
Эксперименты проводили в строго определённый временной промежуток: с 9 до 15 часов, в искусственно освещённом, максимально ограниченном от поступления посторонних шумов помещении. До начала исследования животные были приучены к рукам экспериментатора. Открытое поле представляло собой квадратную площадку размером 90 x 90 см с непрозрачными бортиками высотой 30 см, разделенную на 36 квадратов, со сторонами 15 см.
Время каждой экспозиции составляло 5 минут. В ходе эксперимента оценивали следующие показатели: число пересеченных квадратов (центральных и периферических), а также продолжительность движения и замирания в них, число и продолжительность вертикальных стоек, замирание в периферических квадратах, число проявлений реакции груминга и ее продолжительность, количество фекальных болюсов.
Регистрацию вышеуказанных показателей производили с помощью разработанной нами компьютерной программы, позволяющей фиксировать частоту, продолжительность и время возникновения каждой оцениваемой реакции из числа последовательно возникающих в течение времени нахождения животного в открытом поле [5]. Достоверность результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты считали достоверным при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Как видно из таблицы, трипептид Gly-His-Lys оказывал значительное влияние на исследованные формы поведения животных. При этом число пересечённых центральных квадратов и время движения в них при использовании всех доз пептида значительно превышало показатели контрольной группы. Так, продолжительность движения в группе животных, получавших пептид в дозе 0,5 мкг/кг, было в 6,8 раз (p<0,05) больше контрольных значений, в дозе 5 мкг/кг – в 4 раза (p<0,05), 50 мкг/кг – в 9,5 раз (p<0,05). Число пересечённых квадратов после введения пептида в дозе 0,5 мкг/кг возрастало в 3,5 раза (p<0,05), в дозе 5 мкг/кг – в 2,8 раза (p<0,01), в дозе 50 мкг/кг – в 5,5 раз (p<0,01). Увеличение данных показателей происходило на фоне уменьшения продолжительности реакции неподвижности (замирания), достигавшего достоверных различий с контрольной группой после введения наименьшей использованной дозы 0,5 мкг/кг. Характер изменения исследованных поведенческих реакций в центральной части экспериментальной установки предполагает наличие у животных снижения проявлений реакции страха после введения пептида.
Показатели поведения крыс в тесте «открытое поле» после введения Gly-His-Lys (M±m)
|
Группа Показатель |
Контроль |
0,5 мкг/кг |
5 мкг/кг |
50 мкг/кг |
|
Центральные квадраты |
||||
|
Замирание (с) |
3,0±0,8 |
2,1±0,1* |
2,6±0,3 |
2,3±0,4 |
|
Движение (с) |
1,2±0,3 |
8,1±2,7* |
4,9±1,3* |
11,4±4,2* |
|
Число пересечённых квадратов |
1,1±0,1 |
3,9±1,3* |
3,1±0,7* |
6,1±1,6* |
|
Периферические квадраты |
||||
|
Замирание (с) |
47,6±15,8 |
4,5±2,5* |
7,8±4,8* |
7,9±5,8* |
|
Движение (с) |
91,6±14,8 |
189,1±7,9* |
151,9±17,8* |
170,8±10,7* |
|
Число пересечённых квадратов |
64,6±12,3 |
124,8±5,9* |
109,0±12,2* |
122,6±11,8* |
|
Вставания (с) |
37,5±7,6 |
48,0±4,7 |
43,4±4,4 |
41,2±6,8 |
|
Число вставаний |
10,9±2,7 |
23,1±2,1* |
19,2±2,9* |
22,4±4,6* |
|
Число фекальных болюсов |
1,5±0,6 |
2,0±0,6 |
0,9±0,4 |
1,1±0,6 |
|
Груминг (с) |
21,6±5,1 |
15,4±3,9 |
28,4±6,5 |
17,9±4,4 |
|
Число проявлений груминга |
1,6±0,4 |
1,7±0,5 |
1,9±0,2 |
1,4±0,3 |
Примечание: * – p<0,05-0,001 по сравнению с показателями контрольной группы.
В периферических квадратах открытого поля во всех подопытных группах животных после введения пептида наблюдалось уменьшение длительности реакции неподвижности. Так, наиболее выраженное изменение данной реакции (на 91 %, p<0,05) отмечалось при введении Gly-His-Lys в дозе 0,5 мкг/кг. С увеличением вводимой дозы пептида эти изменения носили менее выраженный характер – на 83 % (p<0,05) в обеих группах.
Изменения реакции движения на месте под действием Gly-His-Lys также имели однонаправленный характер. При этом использование пептида в наименьшей дозе 0,5 мкг/кг приводило к наиболее значительному снижению данного показателя (на 71 %, p<0,001). Дальнейшее увеличение дозы вводимого препарата также вызывало уменьшение длительности реакции движения на месте: в группе животных, получавших Gly-His-Lys в дозе 5 мкг/кг на 48 % (p<0,05), а в дозе 50 мкг/кг – на 51 % (p<0,05).
Уровень горизонтальной двигательной активности, отражаемый временем движения животного и числом пересеченных квадратов, находился в обратной зависимости от значений реакции неподвижности. Во всех подопытных группах отмечалось увеличение длительности реакции движения по сравнению с контрольными животными. Применение пептида в дозе 0,5 мкг/кг приводило к росту продолжительности данной поведенческой реакции на 106 % (p<0,001), в дозе 5 мкг/кг – на 66 % (p<0,05), в дозе 50 мкг/кг – на 87 % (p<0,001).
Подобные изменения закономерно наблюдались и при оценке числа пересеченных периферических квадратов. Использование пептида в заданном диапазоне доз приводило к выраженному и достоверному увеличению указанного показателя на 93 % (p<0,001) при дозе 0,5 мкг/кг; на 69 % (p<0,05) при дозе 5 мкг/кг и на 90 % (p<0,01) при дозе 50 мкг/кг (таблица).
Влияние пептида на уровень вертикальной ориентировочно-исследовательской активности имело выраженный характер. Так, в минимальной использованной дозе 0,5 мкг/кг Gly-His-Lys увеличивал количество вставаний в арене на 112 % (p <0,01). В подопытной группе, получавшей препарат в дозе 5 мкг/кг, уровень вертикальной активности превышал контрольные значения на 76 % (p <0,05). Дальнейшее увеличение вводимой дозы до 50 мкг/кг сопровождалось активацией данной формы поведения, которая достигала достоверных различий с контрольными значениями (на 106 %, p < 0,05). Данный факт, свидетельствующий в пользу повышения уровня исследовательской активности и, одновременно, уменьшения тревожности, является очередным подтверждением предполагаемой анксиолитической направленности действия пептида Gly-His-Lys.
Одним из важных компонентов поведенческой реакции, отражающим эмоциональность, является изменение количества фекальных болюсов. Применение пептида в дозе 0,5 мкг/кг вызывало увеличение данного показателя на 33 %. Вместе с тем, с дальнейшим увеличением вводимой дозы пептида, напротив, отмечалось снижение числа болюсов в группе, получавшей препарат в дозе 5 мкг/кг (на 40 %) и в дозе 50 мкг/кг (на 27 %). Однако данные изменения не имели статистически значимых различий с показателями контрольной группы.
Характер изменений продолжительности и числа проявлений реакции груминга во всех подопытных группах не имели определённой направленности и различия в сравнении с показателями контрольной группы. Так, при использовании пептида в дозе 0,5 мкг/кг длительность указанной реакции снижалась на 29 % при незначительном увеличении числа вставаний. Дальнейшее повышение дозы Gly-His-Lys до 5 мкг/кг сопровождалось увеличением длительности реакции (на 32 %) и числа проявлений (на 19 %). Однако введение трипептида в наибольшей из используемых доз 50 мкг/кг приводило к противоположному эффекту и снижало продолжительность реакции груминга (на 17 %) и количество проявлений этой реакции (на 12 %).
Обсуждение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение трипептида Gly-His-Lys способствовало достоверному повышению горизонтальной и вертикальной двигательной активности при отсутствии существенных изменений эмоциональности, оцениваемой по реакциям дефекации и груминга.
Известно, что помещение животного в новую обстановку ведет к возникновению исследовательского поведения, которому препятствует возникающий при этом страх. Наиболее важных признаков снижения уровня страха является активация исследования животным центральных квадратов [4]. Обычно данная ситуация постепенно развивается при исследовании поведения на протяжении нескольких дней за счет угасания страха. В условиях нашей работы ослабление страха достигалось за счет влияния пептида, что в свою очередь могло способствовать усилению ориентировочно-исследовательской реакции в виде вертикальной и горизонтальной двигательной активности.
В пользу ослабления страха свидетельствует и ослабление реакции замирания как в центральных, так и периферических квадратах. Необходимо отметить, что тревожность животных в первые минуты пребывания в новой обстановке может проявляться как в усилении двигательной активности, так и в противоположной реакции замирания. Поэтому отмеченное нами на фоне угнетения реакции замирания усиление двигательной активности, вероятно, именно вследствие усиления исследовательского поведения и не является проявлением панической реакцией животных в условиях стресса. При этом нами не было установлено различий с контрольной группой по уровню эмоциональности, которую оценивали по реакциям дефекации и груминга. Данную реакцию относят к «категории комфортного поведения», однако груминг у грызунов является специфической общепризнанной реакцией на стресс [6, 12, 13]. Существенными факторами, определяющими состояние страха и тревожности, являются и показатели дефекации [6, 4, 16]. Поэтому отсутствие изменения данных показателей эмоционального состояния животных после введения Gly-His-Lys на фоне других проявлений ослабления реакции страха требует проведения дальнейших исследований в данном направлении.
Также важно отметить, что полученные данные об анксиолитическом действии пептида Gly-His-Lys являются очередным подтверждением существующих взглядов о полифункциональном характере эффектов регуляторных пептидов [3, 7].
Заключение
Трипептид Gly-His-Lys при внутрибрюшинном введении у крыс по результатам теста «открытое поле» вызывал снижение проявлений страха и тревожности, которое выразилось в повышении ориентировочно-исследовательской активности и ослаблении реакции замирания, в том числе и в центральной части экспериментальной установки. Характер полученных результатов позволяет предполагать наличие у пептида нейротропных эффектов, в том числе анксиолитического.