Научный журнал
Успехи современного естествознания
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,775

БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКИМ ОСТЕОМИЕЛИТОМ, И ИХ АССОЦИАЦИЙ, ПОЛУЧЕННЫХ IN VITRO

Шипицына И.В. 1 Осипова Е.В. 1
1 ФГБУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г.А. Илизарова Минздрава России»
Исследована биопленкообразующая способность, выделенных у 64 пациентов с хроническим остеомиелитом длинных трубчатых костей из свищей в дооперационном периоде и из очага воспаления во время операции, 93 клинических штаммов бактерий, принадлежащих к 6 таксонам и их ассоциаций, полученных in vitro. Среди грамотрицательных микроорганизмов чаще встречаются средне- и высокоадгезивные штаммы, в группе грамположительных микроорганизмов – низкоадгезивные штаммы. Штаммы P. aeruginosa, Kl. pneumonia, S. marcescens активнее формируют биопленку на поверхности 96-и луночных планшетах в отличие от штаммов S. aureus, S. epidermidis, Enterococcus sp., что согласуется с данными адгезивной активности исследуемых культур.
биопленки
хронический остеомиелит
адгезия
ассоциации микроорганизмов
1. Бриллис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. и соавт. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лабораторное дело. – 1986. – № 4. С. 210-212.
2. Габидуллин З.Г., Габидуллин Ю.З., Ахтариева А.А. и соавт. Характеристика свойств, определяющих персистенцию моно- и ассоциированных культур условно-патогенных энтеробактерий // Журн. микробиол. – 2006. – № 4. – С. 62-64.
3. Гайдышев И.П. Решение научных и инженерных задач средствами Excel, VBA и C/C++. – СПб.: ВХВ Петербург, 2004. – 505 с.
4. Леонова С.Н. Причины и профилактика хронического травматического остеомиелита // Травматол. и ортопедия России. – 2006. – № 2. С. 186 – 187.
5. Пхкадзе Т.Я., Окропиридзе Г.Г., Малышева Э.С. Микробиологический контроль в современной высокотехнологичной травматологии и ортопедии. // Клиническая лабораторная диагностика. – 2007. – №9. – С.22а-22.
6. Розова Л.В., Годовых Н.В. Сравнительная характеристика видового состава микроорганизмов при хроническом посттравматическом и гематогенном остеомиелите // Гений ортопедии. – 2014. – №2. – С. 56-59.
7. Романова Ю.М., Диденко Л.В., Толордава Э.Р. и соавт. Биопленки патогенных бактерий и их роль в хронизации инфекционного процесса. Поиск средств борьбы с биопленками. // Вестник РАМН. – 2011. – № 10. – С. 31-39.
8. OʼToole G.F., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development // Mol. Microbiol. – 1998. – № 30. – Р. 295-304.
9. Ryder MA. Catheter-related infections: It›s all about biofilm. // Topics in Advanced Practice Nursing Journal.- 2005. № 5. – Р. 3-21.
10. Stepanovic S., Vukovi ć D., Jezek P. et al. Influence of dynamic conditions on biofilm formation by staphylococci // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. – 2001. – № 20. – Р. 502-504.

Хронический остеомиелит остается одной из сложных и актуальных проблем гнойной хирургии [4]. В успешном лечении остеомиелита наряду с традиционными хирургическими методами немаловажную роль играет своевременная микробиологическая диагностика, позволяющая выявить возбудителя инфекции. Наиболее частыми возбудителями хронического остеомиелита являются грамположительные кокки рода Staphylococcus spp. с преобладанием штаммов S. aureus, и грамотрицательные микроорганизмы: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa и др. [5, 6]. В последние годы наблюдается тенденция к повышению удельного веса ассоциаций микроорганизмов, вызывающих инфекционный процесс при остеомиелите. Совместное развитие микроорганизмов в микс-популяции может приводить к усилению патогенного потенциала, ассоциированного с персистентными свойствами бактерий [2]. Комплекс биологических свойств бактерий-ассоциантов определяет их способность к образованию биопленки, в составе которой микроорганизмы намного устойчивее к антимикробным препаратам и факторам иммунной защиты макроорганизма [7, 9]. Изучение этиологической роли микробных сообществ, их биопленкообразующей способности имеет большое практическое значение для оценки эффективности проводимой антибиотикотерапии, поиска новых путей диагностики и подавления роста биопленок.

Цель исследования. Изучить адгезивный потенциал клинически значимых штаммов микроорганизмов, выделенных у больных хроническим посттравматическим остеомиелитом, и оценить биопленкообразующую способность монокультур микроорганизмов и их ассоциаций, полученных in vitro.

Материалы и методы исследования

Исследованы 93 клинических штаммов бактерий, принадлежащих к 6 таксонам (Staphylococcus aureus – 30, Staphylococcus epidermidis – 18 Enterococcus sp. – 18, Pseudomonas aeruginosa – 11, Klebsiella pneumonia. – 10, Serratia marcescens – 6), выделенных из свищей в дооперационном периоде и из очага воспаления во время операции у 64 пациентов с хроническим остеомиелитом длинных трубчатых костей. Изучена биопленкообразующая способность монокультур и их ассоциаций, полученных in vitro (S. aureus + P. aeruginosa – 6; S. aureus + Kl. pneumonia – 5; S. aureus +S. marcescens – 6; S. aureus + S. epidermidis – 2; S. aureus+ Enterococcus sp. – 2).

Выделение и идентификацию исследуемых штаммов проводили общепринятыми методами [1].

Адгезивную активность штаммов изучали на модели эритроцитов человека А (ІI) Rh+ по методике В.И. Брилиса [1]. При оценке адгезивных свойств использовали индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ). Исследование проводили под световым микроскопом, учитывая в общей сложности не менее 50 эритроцитов. Микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ – до 1,75; низкоадгезивными – от 1,76 до 2,5; среднеадгезивными – от 2,51 до 4,0; высокоадгезивными – ≥4,1.

Способность к образованию биопленки клиническими штаммами на поверхности 96-луночных полистироловых планшетов проводили по методу G.OʼToole и R. Kolter [8]. По уровню адсорбции красителя этанолом, измеренному в единицах оптической плотности (OD630) на фотометре ELx808 (BioTek, США) при длине волны 630 нм оценивали активность формирования биопленки. Для интерпретации полученных данных определяли способность штаммами формировать биопленки в соответствии с критериями, разработанными Stepanovic S. et al. [10]: при значениях OD630 ниже 0,090 – считали, что штаммы не обладали способностью к образованию биопленки; при 0,090<OD630≤0,180 – штаммы обладали слабой; при 0,180<OD630≤0,360 – средней; при OD630˃0,360 – высокой способностью к образованию биопленки. Ассоциации микроорганизмов in vitro получали путем смешивания суточных культур штаммов в соотношении 1:1 в лунках планшетов.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения анализа данных AtteStat, версия 13.0 [3]. Значимость различий между группами проверяли с помощью непараметрических критериев Вилкоксона и Манна-Уитни. Различия между группами наблюдений считали статистически значимыми при Р< 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Проведенное исследование показало, что распределение по степени адгезивности неодинаково для рассматриваемых групп микроорганизмов. Так, в группе грамположительных бактерий ИАМ изменялся от 1,92 ± 0,18 ед. у штаммов Enterococcus sp. до 2,20 ± 0,12 ед. у штаммов S. aureus. Среднеадгезивными свойствами обладали 23 % штаммов грамположительных микроорганизмов. Высокоадгезивных штаммов выявлено не было.

Все штаммы грамотрицательных микроорганизмов обладали адгезивной способностью. Большую часть грамотрицательных бактерий составили среднеадгезивные штаммы (70 % штаммов Kl. pneumonia, 46 % штаммов Ps. aeruginosa, 50 % штаммов S. marcescens). ИАМ изменялся от 2,74 ± 0,19 ед. у штаммов Ps. aeruginosa до 3,45 ± 0,24 ед. у штаммов Kl. pneumonia. В группе грамотрицательных микроорганизмов 20 % штаммов Kl. pneumonia, 18 % штаммов P. aeruginosa, 33 % штаммов S. marcescens обладали высокоадгезивными свойствами (таблица).

По данным фотометрического анализа наиболее активно биопленку на поверхности 96-луночного полистиролового планшета формировали грамотрицательные микроорганизмы, о чем свидетельствуют средние значения OD630 (рисунок).

Штаммы грамположительных микроорганизмов характеризовались низкой биопленкообразующей способностью, что согласуется с данными их адгезивной активности.

Адгезивная способность клинически значимых штаммов бактерий, выделенных у больных хроническим посттравматическим остеомиелитом

Штаммы

НеАШ, %

НАШ, %

САШ, %

ВАШ, %

ИАМ, ед.

S. aureus (n=30)

19

52

29

-

2,20 ±0,12

S. epidermidis (n= 18)

24

52

24

-

1,97±0,23

Enterococcus sp. (n=18)

28

56

17

-

1,92±0,18

Kl. pneumonia (n=10)

-

10

70

20

3,45±0,24

P. aeruginosa (n=11)

-

36

46

18

2,74±0,19

S. marcescens (n=6 )

-

17

50

33

3,45±0,28

Примечание. НеАШ – не адгезивные штаммы; НАШ – низкоадгезивные штаммы; СШ – среднеадгезивные штаммы; ВАШ – высокоадгезивные штаммы; ИАМ – индекс адгезивности микроорганизмов.

schi1.tif

Рис. 1. Биопленкообразующая способность клинически значимых штаммов микроорганизмов, выделенных у больных хроническим посттравматическим остеомиелитом. Примечание. * – уровень значимости различий по сравнению с 24 ч (р˂0,05)

Через 48 ч наблюдали активный рост биопленок, образованных штаммами S. aureus, P. aeruginosa, S. marcescens по сравнению со значениями, полученными через 24 ч.

Биопленкообразующая способность штаммов Enterococcus sp. через 48 ч. была в 1,4 раза ниже суточных результатов.

Ассоциации микроорганизмов S. aureus + P. aeruginosa и S. aureus + S. marcescens обладали средней биопленкообразующей способностью, S. aureus + Kl. pneumonia – слабым биопленкообразованием. Микс – культуры грамположительных микроорганизмов (S. aureus + S. epidermidis, S. aureus + Enterococcus sp.) не формировали биопленки на поверхности 96-и луночных планшетах (рис. 2).

schi2.tif

Рис. 2. Биопленкообразующая способность микс – культур микроорганизмов полученных in vitro через 24ч /48 ч. Примечание. * – уровень значимости различий по сравнению с 24 ч. (р˂0,05)

Уровень биопленкообразования микс-культур микроорганизмов через 48 ч. эксперимента был выше по сравнению с результатами на первые сутки, однако значения оптической плотности, в большинстве случаев, не превышали уровни биопленкообразования монокультур исследуемых штаммов. Биопленкообразующая способность ассоциаций микроорганизмов S. aureus + P. aeruginosa через 48 ч. была в 1,2 раза выше по сравнению с уровнем биопленкообразования монокультур штаммов P. aeruginosa. Рост биопленок, образованных ассоциациями микроорганизмов: S. aureus + Kl. pneumonia, S. aureus + S. marcescens был незначительным по сравнению с биопленкообразующей способностью монокультур штаммов Kl. pneumonia, S. marcescens соответственно.

Высокая биопленкообразующая способность ассоциации микроорганизмов: S. aureus + P. aeruginosa по сравнению с чистыми культурами исследуемых штаммов объясняется взаимоотношениями, характер которых зависит от физиологических особенностей и потребностей совместно развивающихся микробов [10].

Заключение

Таким образом, у больных с хроническим остеомиелитом среди грамотрицательных микроорганизмов чаще встречаются средне- и высокоадгезивные штаммы, а в группе грамположительных микроорганизмов – низкоадгезивные штаммы. Штаммы P. aeruginosa, Kl. pneumonia, S. marcescens активнее формируют биопленку на поверхности 96-и луночных планшетах в отличие от штаммов S. aureus, S. epidermidis, Enterococcus sp., что согласуется с данными адгезивной активности исследуемых культур. Проведенное исследование показало, что межмикробные взаимоотношения в ассоциациях микроорганизмов в зависимости от индивидуальных свойств каждого ассоцианта могут быть направлены как на стимуляцию роста биопленки, так и на его ослабление. Со временем свойства образующих ассоциации штаммов могут изменяться, соответственно, будет изменяться и способность микс-культуры к образованию биопленки.


[1] Выполнено м.н.с. Л.В. Розовой и Н.В. Годовых.


Библиографическая ссылка

Шипицына И.В., Осипова Е.В. БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКИМ ОСТЕОМИЕЛИТОМ, И ИХ АССОЦИАЦИЙ, ПОЛУЧЕННЫХ IN VITRO // Успехи современного естествознания. – 2015. – № 1-6. – С. 958-961;
URL: https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=34982 (дата обращения: 29.03.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674