Несмотря на внедрение новых хирургических технологий лечения пациентов с повреждениями крупных суставов, число неблагоприятных исходов ежегодно увеличивается, что указывает на необходимость поиска новых подходов и парадигм [8]. Установлено, что, синовиальная жидкость оказывает ингибирующее влияние на заживление внутрисуставного перелома [5]. Являясь фильтратом плазмы крови, она включает дополнительные компоненты, замедляющие процесс репаративного остеогенеза и характеризуется высоким, по сравнению с плазмой крови, содержанием аскорбиновой кислоты [9, 10]. После травмы концентрации компонентов системы антиоксидантной защиты аскорбата и супероксиддистмутазы (СОД) в синовиальной жидкости значительно снижаются [7]. Излившаяся кровь является дополнительным негативным фактором для заживления перелома, так как разрушение эритроцитов в условиях гипоксии приводит к накоплению избытка ионов железа, что на фоне сниженной активности СОД усугубляет тяжесть вторичного посттравматического повреждения тканей [2].
С учетом перечисленных патогенетических факторов, предложен способ нейтрализации и удаления цитотоксических соединений из полости сустава путем капельного дренирования композицией лекарственных веществ, включающей аутологичную плазму крови в сочетании с официнальными растворами аскорбиновой кислоты и глюкозы (патент РФ № 2463986). Применение данной методики на собаках позволило добиться формирования костного сращения уже на 14 сутки после моделирования перелома вертлужной впадины, в три раза сократив период консолидации и снизив при этом выраженность дегенеративных изменений в суставном хряще [3, 4]. Однако в данном эксперименте не были изучены ранние сроки заживления перелома, что не позволило судить о механизмах феномена. Для продолжения исследований, по нашему мнению, целесообразна адаптация модели внутрисуставного повреждения для мелких лабораторных животных, что согласуется с концепцией альтернативных подходов в экспериментальной биологии и медицине [1].
Целью настоящей работы являлось тестирование биологической активности композиции на основе плазмы крови, аскорбиновой кислоты и глюкозы при дозированном внутрисуставном введении на модели линейного сквозного костно-хрящевого повреждения вертлужной впадины крыс в раннем посттравматическом периоде.
Материалы и методы исследования
Экспериментальное исследование проведено на 20 крысах Вистар обоего пола в возрасте 10 месяцев, массой тела от 250 до 350 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Оперативные вмешательства и эвтаназия осуществлялись в соответствии требованиями Минздрава России к работе экспериментально-биологических клиник, а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» и были одобрены этическим комитетом ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова».
Получение модели линейного сквозного костно-хрящевого повреждения вертлужной впадины (патент РФ № 2470378) выполняли в стерильных условиях под общим комбинированным наркозом: золетил 100 («Virbac Sante Animale», Франция) 8 мг/кг, ксилазин 2 % («Alfasan International B.V.», Голландия) 4.0 мг/кг, внутримышечно. В области шейки бедренной кости вскрывали капсулу сустава и производили вывих головки из вертлужной впадины. Далее с помощью хирургической пилы толщиной 0,2 мм производили поперечный пропил вертлужной впадины со стороны ее дорсальной части до уровня середины суставной ямки, после чего выполняли резекцию головки и шейки бедренной кости [8]. Через операционную рану в суставную полость устанавливали мягкий катетер диаметром 0,6 мм Перификс («B. Braun», Германия) и ушивали капсулу сустава нитью из полипропилена 3/0 (рис. 1, а). Операцию завершали выполнением контрольной рентгенографии (рис. 1, б).
Со 2 по 5 сутки после операции в полость сустава ежедневно, однократно вводили 0,2 мл растворов лекарственных веществ (рис. 1, в). Животным контрольной группы (n = 10) инъецировали 0,9 % раствор натрия хлорида. В опытной группе (n = 10) выполняли инъекции композиции, состоящей из гомологичной плазмы крови, официнальных растворов 5 % аскорбиновой кислоты и 40 % глюкозы, взятых в объемном соотношении 7:2:1 (патент РФ № 2463986). Кровь для получения плазмы забирали у интактных животных, используя вакуумные системы с гепарином. Плазму отделяли центрифугированием в лабораторной центрифуге «ОПн-3М» («Дастан», Кыргызстан) при 1000 об/мин в течение 10 мин. Аликвоты плазмы крови объемом 1 мл помещали в пластиковые пробирки с крышками типа Eppendorf и замораживали при – 20 °С. Перед выполнением инъекций плазму размораживали при 37 °С. Для стерилизации растворов использовали бактериальный фильтр Перификс 0,2 µ («B. Braun», Германия).
а б
в г
Рис. 1. Моделирование повреждения вертлужной впадины крысы: вид операционной раны (а); рентгенограмма пояса тазовых конечностей после операции, дорсо-вентральная проекция (б); внутрисуставное введение композиции лекарственных веществ через коннектор (в); рентгенограмма макропрепарата оперированной вертлужной впадины, латеральная проекция (г)
а б
в г
Рис. 2. Влияние остеоиндуцирующей композиции на гистоструктуру вертлужной впадины крыс в области моделирования повреждения: заполнение диастаза между раневыми поверхностями кости детритом с лейкоциарной инфильтрацией в контроле (а) и грануляционной тканью – в опыте (б); Ki-67-негативное окрашивание костного мозга в контроле (в) и выявление Ki-67-позитивных стромальных механоцитов (указаны стрелками) в костном мозге животных опытной группы (г). Срок эксперимента – 5 суток. Парафиновые срезы. Окраска гематоксилином и эозином, ×400 (а, б). Иммуногистохимическое определение экспрессии Ki-67 (коричневое окрашивание) с докраской гематоксилином, ×400 (в, г)
Рис. 3. Влияние остеоиндуцирующей композиции на клеточный состав зоны внутрисуставного повреждения вертлужной впадины крыс через 5 суток эксперимента
По истечении 5 суток после операции, животных эвтаназировали передозировкой тиопентала натрия («Синтез», Россия,) 45 мг/кг, внутривенно. Поврежденную суставную впадину вычленяли и выполняли контрольную рентгенографию (рис. 1, г).
Полученный костный блок освобождали от пароссальных тканей и помещали на 3 суток в смесь 2 % растворов глутарового и параформальдегидов на фосфатном буфере (рН 7,4). Затем образцы обезжиривали в ацетоне, декальцинировали в 10 % растворе Трилона Б (рН 7,4) и заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Экспрессию маркера пролиферативной активности клеток Ki-67 определяли с использованием набора реактивов для иммуногистохимии и системы визуализации RE7140-К («Novocastra», Великобритания).
Исследование гистологических препаратов производили с использованием стереомикроскопа AxioScope.A1 и цифровой камеры AxioCam ICc 5 в комплекте с программным обеспечением Zen blue («Carl Zeiss MicroImaging GmbH», Германия). При микроскопировании с объективом 100× для масляной иммерсии оценивали клеточную плотность в 1 мм2 площади среза для категорий «клеточный детрит» «общая клеточная плотность», «фибробластоподобные клетки», «сегментоядерные лейкоциты», «мононуклеарные фагоциты», «полинуклеарные фагоциты», «эндотелиоциты». Измерения выполняли в 10 полях зрения для каждого экспериментального случая, при этом подсчитывали не менее 300 клеток. Значения митотического индекса фибробластоподобных клеток выражали в промилле ( ‰). Для статистического анализа данных использована программа AtteStat, версия 13.1 (свидетельство № 2002611109). Результаты приведены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M ± m). Межгрупповые отличия оценивали с применением непарного t-критерия Стьюдента для независимых выборок.
Результаты исследования и их обсуждение
При исследовании зоны перелома вертлужной впадины у животных контрольной группы было установлено, что диастаз между отломками был заполнен фибрином и тканевым детритом, включающим поля некротически измененных клеток с выраженным криопикнозом, кариорексисом либо кариолизисом. В клеточном составе преобладали сегментоядерные лейкоциты и мононуклеарные фагоциты, характерные для воспалительной стадии репаративного процесса, а также встречались немногочисленные лимфоциты (рис. 2, а).
О начале пролиферативной стадии репарации свидетельствовало присутствие фибробластоподобных веретеновидных клеток с крупным базофильным ядром, содержащим 1–2 ядрышка. Индекс их митотической активности был чрезвычайно высоким, составляя 26,8 ‰. В костном веществе вертлужной впадины на протяжении 0,5–2 мм от линии повреждения наблюдали пустые костные лакуны и безъядерные остеоциты, лейкоцитарную инфильтрацию костного мозга (рис. 2, в).
У животных опытной группы диастаз заполняла грануляционная ткань с большим количеством тонкостенных капилляров, выстланных изнутри уплощенными ядросодержащими клетками – эндотелиоцитами. В ее составе преобладали веретеновидные или слабоотросчатые фибробласты, отличающиеся эксцентрично расположенным базофильным эухроматиновым ядром с 1–2 ядрышками и слабо базофильной цитоплазмой. Индекс их митотической активности составлял 2,5 ‰. Также обнаруживались мононуклеарные фагоциты – моноциты и макрофаги. На поверхности травмированных костных трабекул располагались активные остеобласты, встречались немногочисленные остеокласты (рис. 2, б). В костной ткани отломков вблизи линии повреждения определялись ядросодержащие остеоциты, на периостальной и эндостальной поверхности – активные остеобласты.
Иммуногистохимический анализ в контрольной группе показал, что Ki-67-позитивными являлись лишь единичные фибробластоподобные клетки зоны сращения. В опытной группе экспрессия маркера обнаруживалась в отросчатых стромальных механоцитах костного мозга, периостальных остеобластах и периваскулярных клетках грануляционной ткани (рис. 2, в, г). Большая часть метки распределялась в ядре, однако цитоплазма клеток также была слабопозитивной.
Сравнительное морфометрическое исследование клеточного состава зоны сращения отломков выявило статистически значимые межгрупповые отличия по каждому из параметров (р < 0,001) (рис. 3).
В контрольной группе численная плотность некротизированных клеток в 1 мм2 площади среза составила 2407 ± 144,4; общая плотность жизнеспособных ядросодержащих клеток – 1091 ± 48,8; фибробластоподобных клеток – 118 ± 17,0; сегментоядерных лейкоцитов – 453 ± 31,1; мононуклеарных фагоцитов – 520 ± 36,5; полинуклеарные фагоциты и эндотелиоциты не определялись. В опытной группе соответствующие значения параметров равнялись 521 ± 18,2; 3790 ± 71,7; 1898 ± 63,2; 160 ± 15,5; 973 ± 31,0; 101 ± 10,2; 657 ± 27,6. Под влиянием внутрисуставных инъекции тестируемой композиции лекарственных веществ численность некротизированных клеток и сегментоядерных лейкоцитов снижалась в 4,5 и 2,8 раза соответственно. Вместе с тем отмечалось более чем трехкратное увеличение численной плотности жизнеспособных ядросодержащих клеток, в том числе фибробластов – в 16 раз и мононуклеарных фагоцитов – в 1,9 раза
Заключение
Таким образом, проведенное исследование показало пригодность разработанной модели сквозного линейного костно-хрящевого повреждения вертлужной впадины мелких лабораторных животных для тестирования биологически активных веществ при их интраартикулярном введении. Полученные результаты позволили раскрыть механизмы, лежащие в основе стимулирующего влияния гомологичной плазмы крови в сочетании с официнальными растворами аскорбиновой кислоты и глюкозы. Выполнение ежедневных однократных внутрисуставных инъекций указанной композиции в остром посттравматическом периоде ускоряет завершение воспалительной стадии репаративного процесса и заполнение диастаза васкуляризированной грануляционной тканью. Выявление экспрессии маркера пролиферации Ki-67 в стромальных механоцитах костного мозга отломков, периостальных остеобластах и периваскулоцитах зоны повреждения свидетельствует об активизации процесса репаративного остеогенеза.
Библиографическая ссылка
Силантьева Т.А., Краснов В.В., Кубрак Н.В. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ И СТИМУЛЯЦИЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ ВНУТРИСУСТАВНОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ У КРЫС // Успехи современного естествознания. – 2015. – № 9-3. – С. 471-475;URL: https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=35614 (дата обращения: 25.04.2024).