Некультивируемыми принято считать бактерии, которые под влиянием различных физико-химических или биологических факторов обратимо утрачивают способность расти на традиционных питательных средах. В настоящее время известно, что 1) переходить в некультивируемую форму (НФ) способны многие виды бактерий, в том числе и возбудители особо опасных инфекций: чумы [11], туляремии [9], холеры [13], 2) в некультивируемом состоянии (НС) клетки сохраняют вирулентность и способны к реверсии [12,15], 3) предполагается, что в НС возбудители различных заболеваний переживают неблагоприятные условия окружающей среды, являясь потенциальным источником заражения [4,13]. Биологические свойства НФ, в том числе и холерных вибрионов, изучены недостаточно. В доступной литературе отсутствуют сведения об особенностях обменных процессов в некультивируемых клетках, в том числе и холерных вибрионов. Между тем они представляет большой научно-практический интерес, так как являются ключевыми для понимания механизмов образования НФ и их выживания в неблагоприятных условиях внешней среды.
Целью настоящей работы является обнаружение функционирования основных энергетических и биосинтетических путей в некультивируемых клетках холерных вибрионов. Для этого изучен катаболизм меченой глюкозы в реакциях цикла Кребса и активность ключевого фермента цикла Кальвина - рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы (РДФК).
Материалы и методы
Для работы использованы три штамма холерных вибрионов: Vibrio cholerae О1 17551, 17558 и V. cholerae О139 17673. По морфологическим, культуральным и биохимическим признакам культуры были типичными. Для получения НФ вибрионы в течение трех часов выращивали на 0,3% агаре Мартена, рН 7,6 с последующим пересевом на 2% агар Мартена, рН 7,7-7,8. Через 18 часов, в зависимости от целей эксперимента, агаровую культуру суспендировали в морской воде, 0,85% растворе NaCl, 1мМ растворе янтарной кислоты, 0,001% растворе витамина Е, 1мМ растворе каталазы или дистиллированной воде. В стеклянных флаконах емкостью 100 мл объем микробной взвеси доводили до 70 мл средой суспендирования и конечной концентрации 109 м.кл/мл. Приготовленные таким образом микрокосмы помещали при + 4оС без освещения. О динамике перехода в НС судили по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) на агаре, для чего каждые 5-7 дней из флаконов с дистиллированной водой и 14 дней из остальных делали высевы. Некультивируемыми считали пробы, в которых высевы на агар не выявляли растущих клеток, но витальным окрашиванием акридиновым оранжевым (разведение 1:5000) обнаруживали подвижные вибрионы, окрашенные в зеленый цвет. В переходных пробах часть клеток (102 - 105 м.кл/мл) еще сохраняла способность расти на питательных средах .
Пути диссимиляции глюкозы изучали радиореспирометрическим методом [16]. В опытах использовали 1С14-, 2С14 -, 6С14 -, 1,6С14 - глюкозу, а также 1.4C14 - янтарную кислоту фирмы «Изотоп». Реакционная смесь объемом 5 мл содержала 5×109 м.кл/мл, суспендированных в 0,85% NaCl, 15 мМ глюкозы-носителя, 0,8 мккюри радиоактивной глюкозы, 60 мМ фосфатного буфера рН 7,8. Выделенную в процессе дыхания углекислоту улавливали 5 N NaOH. Инкубацию проводили в течение трех и семнадцати часов при 37оС. «Ловушки» помещали в 96о этиловый спирт, который затем переносили в сцинтилляционную жидкость. Радиоактивность исследуемых проб измеряли счетчиком Mark II (Searle, USA). Результаты выражали в имп/мин.
Для определение активности РДФК культуру концентрировали центрифугированием при 10000 g 15 мин. Клетки разрушали растиранием с песком, отмывали фосфатным буфером, рН 7,6. Реакционная смесь содержала 18мМ Трис-НСl, pH 8.0, 20мM MgCl2 × 6H2O , 10мM дитиотреитола, 4мМ рибозо - 5 - дифосфата и 500 мкл суспензии разрушенных клеток. Смесь инкубировали 30 мин при 30оС для превращения рибозо-5-фосфата в рибулозо-5-дифосфат под действием эндогенной фосфорибоизомеразы. В реакционную смесь добавляли 0,026мМ NaHC14 O3 , 6мМ АТФ, 0,6 мМ НАДН и инкубировали 5 мин. Реакцию останавливали 0,02 мл 100% трихлоруксусной кислотой. Центрифугировали 30 мин при 8000g, 200 мкл супернатанта помещали в 5 мл сцинтилляционной жидкости. Радиоактивность измеряли счетчиком Mark II. Активность фермента выражали в имп/мин.
Результаты и обсуждение
Углеводы являются важным источником энергии и углерода для микроорганизмов. Утилизация энергии углеводов клеткой происходит в цепи последовательных реакций фосфорилирования промежуточных продуктов, дегидрирования, переноса электронов на кислород или другие акцепторы. Механизм диссимиляции различных сахаров отражает не существование какого-либо специфического пути их распада, а лишь способность микроорганизма к синтезу некоторых ферментов, катализирующих превращение конкретных субстратов [5]. Поэтому изучение процессов диссимиляции глюкозы у НФ вибрионов позволяет судить о катаболизме углеводов в целом.
К настоящему времени известно три пути диссимиляции углеводов до С3-соединений и пирувата. Это гликолиз (или путь Эмбдена - Мейергофа - Парнаса), гексозомонофосфатный путь (пентозофосфатный цикл) и, встречающийся только у некоторых бактерий, путь Энтнера - Дудорова. Гликолиз и гексозомонофосфатный шунт функционируют у холерных вибрионов одновременно, обеспечивая клетку энергией и компонентами синтеза белков, жиров, нуклеиновых кислот. По гликолитическому пути расщепляется 89-93% глюкозы, а на долю гексозомонофосфатного шунта приходится 7-11% [1].
Установить метаболические пути, в которые вовлекается углевод, позволяет сопоставление количественного выхода радиоактивного СО2 в процессе распада 1С14 - и 6С14- глюкозы. Известно, что включение радиоактивных меток в углекислоту наблюдается при распаде 1С14 -- глюкозы по гексозо-монофосфатному пути (ГМФП). Точкой образования радиоактивного СО2 является реакция декарбоксилирования 6-фосфоглюконата, образующегося из глюкозо-6-фосфата. Использование в опыте 6С14 - глюкозы приводит к тому, что это атом, также как и первый (в отличие от остальных атомов) при распаде карбогидрата по пути Эмбдена-Мейергофа попадает в метильную группу пирувата, и при дальнейшем метаболизме в цикле Кребса судьба шестого атома углерода аналогична судьбе первого. Однако при распаде 6С14- глюкозы по ГМФП включение метки в СО2 на происходит, так как при декарбоксилировании 6-фосфоглюконата шестой углеродный атом переходит в состав рибулозо-5-фосфата. Обычно одинаковая радиоактивность СО2 наблюдается при диссимиляции 1С14 - и 6С14- глюкозы и указывает на расщепление молекул карбогидрата по пути Эбдена-Мейергофа (гликолиза) с последующей утилизацией продуктов распада в цикле Кребса (цикле ди- и трикарбоновых кислот).
Результаты изучения путей диссимиляции глюкозы исходных, переходных и НФ холерных вибрионов с использованием глюкозы, меченой по первому или шестому атомам, представлены в Таблице 1. Изучение динамики изменений катаболизма глюкозы в клетках холерных вибрионов, пребывающих в микрокосмах, показало, что в популяциях, в которых 102- 103 м.кл/мл сохраняют способность расти на агаре Мартена, наблюдаются значительные изменения утилизации углеводов. Также как и в исходных культурах, в переходных и НФ уровень радиоактивности СО2, выделенного в результате катаболизма глюкозы, меченой по первому и шестому атомам, был приблизительно равным.
Таблица 1.
Радиоактивность выделенного СО2 при диссимиляции глюкозы некультивируемыми штаммами V.cholerae eltor и их исходными вариантами (2 часа инкубации)
Штаммы |
Форма |
Время в НС |
Количество метки в % добавленной радиоактивности |
|
1С14- глюкоза |
6С14 - глюкоза |
|||
V. cholerae eltor 17551 |
исходная |
- |
23,9 |
16,8 |
перех. |
рост 105 |
0,04 |
0,039 |
|
V. cholerae eltor 17551 |
исходная |
- |
29,5 |
26,7 |
перех. |
рост 102 |
0,01 |
0,008 |
|
V. cholerae eltor 17551 |
исходная |
- |
26,4 |
22,7 |
НФ |
3 сут. |
0,007 |
0,006 |
|
V. cholerae eltor 17551 |
исходная |
- |
29,8 |
23,4 |
НФ |
14 сут. |
0 |
0 |
|
V. cholerae eltor 17551 |
исходная |
- |
21,9 |
19,6 |
НФ |
4 мес. |
0 |
0 |
|
V. cholerae eltor 17558 |
исходная |
- |
30,6 |
29,4 |
НФ |
4мес. |
0 |
0 |
Также как и в исходных культурах, в переходных и НФ уровень радиоактивности СО2, выделенного в результате катаболизма глюкозы, меченой по первому и шестому атомам, был приблизительно равным. Однако уровень радиоактивности переходных и некультивируемых проб после двух часов инкубации был значительно ниже, чем у исходных вариантов. Выделение радиоактивного углекислого газа пропорционально длительности пребывания в микрокосмах. Через два часа инкубации остаточный уровень радиоактивности обнаружен в трехдневных некультивируемых пробах, в то время как в четырнадцатидневных и более старых радиоактивный респираторный СО2 не обнаружен.
Увеличение времени инкубации с радиоактивной меткой до 17-18 часов в наших опытах привело к увеличению выхода меченого СО2 и позволило обнаружить его у 14-дневных НФ (Таблица 2).
Таблица 2
Радиоактивность СО2, выделенного при диссимиляции 1С14-глюкозы исходными и НФ холерных вибрионов при разном времени инкубации
Штаммы |
Время в НФ |
Форма |
Радиоактивность СО2 , имп/мин |
|
2часа |
17 часов |
|||
V. cholerae eltor 17551 |
- |
исходная |
21,840 |
157,580 |
-//- |
- |
переходная |
1,102 |
16,127 |
-//- |
3 сут. |
НФ |
0,007 |
2,420 |
-//- |
14 сут. |
НФ |
0 |
0,507 |
Выделение углекислоты в результате утилизации 1С14-глюкозы по сравнению с исходными культурами в НФ снизилось до 1,5% - 0,3% у трехдневных и четырнадцатидневных вариантов соответственно. В переходных пробах этот показатель составил 10,4%. Увеличение времени инкубации до 17 часов позволило обнаружить остаточный уровень радиоактивности и в 25-дневных пробах. Согласно данным литературы [7], суммарная скорость образования респираторного СО2 из атома 1С14-глюкозы, прямо характеризует скорость катаболизма по пентозофосфтному пути. Однако в системе гликолиз - цикл Кребса также может происходить эта реакция. Но превращение атома С1 в СО2 по пентозофосфатному пути является быстрым процессом (включает три ферментативных стадии), в то время, как соответствующие превращения в системе гликолиз - цикл Кребса предполагает прохождение всех реакций гликолиза и более чем однократного прохождения ферментативных реакций цикла Кребса, что ведет к замедленному выходу радиоактивного СО2.
С целью обнаружения функционирования цикла Кребса в НФ использовали 2С14-глюкозу и 1,4С14-янтарную кислоту. Известно, что второй углеродный атом глюкозы при превращении ее по пути Эмбдена-Мейергофа попадает в карбоксильную группу ацетата и выделяется в виде радиоактивной углекислоты при диссимиляции в цикле Кребса на уровне α-кетоглутарата на втором обороте цикла. Также как и при использовании глюкозы, меченой по первому и шестому атомам, выход радиоактивного углекислого газа в НФ значительно ниже, чем в исходных культурах. В результате утилизации 2С14-глюкозы он составил 20,2% от исходного, а 1,4С14-янтарной кислоты - 19% процентов Обнаружено, что 2С14- глюкоза включается в СО2 у четырнадцатидневных НФ, в то время, как 6С14-глюкоза не приводит к выходу радиоактивной углекислоты. Можно предположить, что у НФ холерного вибриона функционирует фрагмент цикла Кребса, где включается карбоксильная группа ацетата. Подтверждением этому предположению является включение 1,4С14 - янтарной кислоты, первый меченый атом которой превращается в 5-й углерод лимонной кислоты с последующим декарбоксилированием на уровне α-кетоглутарата, что приводит к выделению радиоактивного углекислого газа уже на первом обороте цикла. (Таблица 3).
Из данных литературы известно, что у некоторых гетеротрофов, например у E. coli [3], Y. pestis [10] может функционировать цикл Кребса, но в разорванном виде, таким образом, что одна часть реакций осуществляется от лимонной кислоты до α-кетоглутаровой, а вторая в обратном направлении - от щевелевоуксусной к янтарной. Запускается такая система реакций на основе метаболитов, получаемых в цикле Кальвина. Эти данные, а также сведения о функционировании цикла Кальвина в вибрионах, длительно пребывающих в морской воде [2] послужили основанием для попытки его выявления в НФ.
Таблица 3.
Радиоактивность СО2 (% от добавленной радиоактивности) при диссимиляции добавленного субстрата исходными и некультивируемыми клетками холерных вибрионов через 2 часа инкубации
Штаммы |
Время в НФ |
Субстрат |
|||
1,4С14-янтарная кислота |
2С14-глюкоза |
||||
исходная |
НФ |
исходная |
НФ |
||
V.cholerae eltor 17551 |
14 сут |
25,107 21,240 23,173 х=23,173 |
3,712 5,177 4,444 х=4,444 |
26,905 21,217 24,061 х=24,061 |
5,115 4,556 4,975 х=4,882 |
С этой целью проведена серия опытов по определению активности одного из двух ключевых ферментов цикла Кальвина - рибулозодифосфаткарбоксилазы (РДФК), систематическое название 3-фосфо-D-глицерат-карбоксилаза димеризующая. Синтез этого энзима клетками свидетельствует о функционировании пентозофосфатного цикла [6]. Указанный фермент катализирует фиксацию СО2 в результате чего образуется первичный стабильный продукт реакции - 3-фосфоглицерат. Функционирование цикла Кальвина обеспечивает клетку гексозами, пентозами для синтеза нуклеиновых кислот, фосфоглицериновым альдегидом, из которого в дальнейшем синтезируется пировиноградная кислота, используемая для образования аминокислот, липидов и других компонентов клетки.
Обнаружено (Таблица 4), что в двухмесячных НФ холерных вибрионов активно функционирует РДФК.
Таблица 4.
Активность рибулозодифосфаткарбоксилазы исходных, переходных и НФ хлерных вибрионов
Штаммы |
Среда микрокосма |
Форма |
Активность (имп/мин) |
V. cholerae eltor 17551 |
физ.р-р |
исходная |
1,833 |
-//- |
морская вода |
переходная |
9,800 |
-//- |
дист.вода |
НФ, 2 мес. |
7,716 |
-//- |
янт. к-та |
НФ, 2 мес. |
12,075 |
-//- |
витамин Е |
НФ, 2 мес. |
1,668 |
-//- |
каталаза |
НФ, 2 мес. |
3,969 |
V. cholerae 0139 17673 |
физ.р-р |
исходная |
1,764 |
-//- |
морская вода |
переходная |
7,980 |
-//- |
дист.вода |
НФ, 2 мес. |
3,634 |
-//- |
янт. к-та |
НФ, 2 мес. |
11,201 |
-//- |
витамин Е |
НФ, 2 мес. |
1,404 |
-//- |
каталаза |
НФ, 2 мес. |
8,660 |
Различий в активности фермента между штаммами не выявлено как у исходных, так и у переходных и НФ. Активность фермента в исходных пробах была на фоновом уровне. Существенные различия получены в пробах из микрокосмов с разным составом. Максимальная активность обнаружена в некультивируемой пробе с добавлением 1мМ янтарной кислоты. Несколько более низкие, но превышающие исходный уровень в 5,4-4,6 раз, значения получены для переходных вариантов в микрокосмах с морской водой. Минимальные значения активности обнаружены в микрокосмах, где в качестве антиоксиданта добавлен витамин Е. Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить: Изменения в диссимиляции глюкозы происходят еще до утраты клетками способности образовывать колонии на питательных средах. Уменьшение количества и замедление выхода радиоактивного углекислого газа в НФ холерных вибрионов, вероятно, связано с перестройкой метаболизма, проявляющемся в сдвиге его в сторону гликолиза и разрывом цепей цикла Кребса, характерным для хемолитоавтотрофов.
Пребывание в условиях микрокосмов при низкой температуре индуцирует функционирования цикла Кальвина, что вероятно, обеспечивает клетку необходимыми пластическими материалами и способствует выживанию при отсутствии органических питательных веществ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Алексеева Л.П. Пути диссимиляции глюкозы, манозы и глюконата у неагглютинирующихся и Эль-Тор вибрионов. Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. - Ростов-на-Дону, 1975.
- Бурша О.С., Каграманов В.С., Соколенко А.В. Определение активности рибулозодифосфаткарбоксилазы у инактивных вариантов Vibrio cholerae eltor. // Журн. микробиол., эпидемиоло. и иммунобиол. - 1999. - № 6.- С. 90.
- Вершигора А.Е. Общая микробиология. - Киев, «Выща школа». 1988 -342с.
- Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. Некультивируемые формы бактерий и их роль в сохранении возбудителей сапронозов во внешней среде. // Журн. микробиол., эпидемол. и иммунобиол. - 1997. - №3. - С.116.
- Голубинский Е.П. Дыхательный аппарат и окислительный метаболизм чумного микроба. Автореф. дис. ... док. мед. наук.Саратов, 1974..
- Готшалк Г. Метаболизм бактерий. М., «Мир», 1982, 310с.
- Доис Э. Количественные проблемы биохимии. М., «Мир», 1983 373с.
- Ломов Ю.М., Асеева Л.Е., Каграманов В.С. Диссимиляция глюкозы штаммами Л-форм холерных вибрионов. //Микробиол. журн. -1983. -Т.45. -№3. - С.42.
- Пичурина Н.Л. Эпидемиологические аспекты туляремии и совершенствование методов лабораторной диагностики (на примере Ростовской области). Автореф. дисс. ...канд.мед.наук - Саратов - 1999.
- Рублев Б.Д. Пути обмена глюкозы и глюконата и окислительное фосфорилирование у чумного микроба. Автореф. дисс.... канд. мед. наук , Ростов-на-Дону, 1972.
- Сучков Ю.Г., Худяков И.В., Емельяненко Е.Н. и др. О возможности сохранения возбудителя чумы в почве в покоящейся форме (некультивируемой форме). // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1997. -№4. -С.42.
- Colwell R.R. Nonculturable but still viable and potentially pathogenic . //
- Int. J. Med. Microbiol.Virol.Parasitol.Infect.Dis. - 1993. -v.279. - N2. -p.154.
- Colwell R.R. Global climate and infections diseas: the cholera paradigm. //Scienc.- 1996.- V.274. -Dec.20.-P.2025
- Colwell R.R., Bryton P. R., Grimes D.J. et.al. Viable but nonculturable Vibrio cholerae and related pahtogenes in the environment: implication for the releas of genetically engineered microorganisms. // Bio/ Technology. - 1985. -V.3. -P.817.
- Nilsson L., Oliver J.D., Kjelleberg S. Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state // J. Bacteriol., -1991.- V.173., -N16,- P.5054.
- Wang C.H., Stern J., Gilmour C.M. et.al. Comparativ study of glucose catabolism by radiorespirometrie method . // J. Bacteriol. - 1958. -V.76. -N1. - P.207.
Библиографическая ссылка
А.В. Соколенко, Ю.М. Ломов, Л.Е. Асеева, В.С. Каграманов, О.С. Бурша ОСОБЕННОСТИ ОБМЕНА НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ // Успехи современного естествознания. – 2002. – № 2. – С. 22-30;URL: https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=13957 (дата обращения: 17.08.2024).