Научный журнал

Успехи современного естествознания

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Трефилов Б.Б. 1 Никитина Н.В. 1 Бочкарев В.С. 1 Борисова М.С. 1

---

1 ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства

Вирулентные и аттенуированные штаммы метапневмовируса (МПВ) птиц различаются по ряду генетических признаков, тщательное их изучение приобрело особое значение для отбора природно-ослабленных и вакцинных штаммов, используемых для специфической профилактики болезни. Проведено изучение генетических маркеров производственных вакцинных штаммов 8544 и VC-03 МПВ птиц, связанных с особенностями их внутриклеточной репликации и выявляемых in vitro. Показано, что штаммы вируса индуцировали острую форму вирусной инфекции в первичных культурах клеток с различным латентным периодом в зависимости от вида культуры. Максимальное их накопление обнаружено в клетках Vero с посевной концентрацией 2×105 кл/см3 при инокуляции монослоя через 48–72 ч и времени съема вируса через 72 ч после заражения. Подтверждена возможность использования трахеальной органной культуры для выделения и изучения маркеров МПВ птиц. Установлена способность штаммов 8544 и VC-03 к репликации в клетках Vero при температурах 34 и 40 °С и к индукции интерферона, концентрация которого была в прямой зависимости от множественности штамма-индуцента. Штаммы вируса чувствительны к действию экзогенного интерферона.

Статья в формате PDF

252 KB

вакцинные штаммы метапневмовируса птиц

генетические маркеры

культуры клеток

репликация

интерферон

1. Беньеш-Мельник М.Б., Дж. Мельник. Маркирующие признаки вируса полиомиелита и их отношение к вирулентности штаммов вируса для обезьян / В сб.: «Полиомиелитная пероральная живая вакцина» – М., 1961. – С. 210–223.

2. Борисова И.А. Разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против Ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц: дисс... канд. биол. наук. – Владимир, 2008. – 167 с.

3. Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. – М.: «Колос», 2000. – 272 с.

4. McDougall J.S. Turkey rhinotracheitis: preliminary investigations / J.S. McDougal, J.K.A. Cook // Vet. Rec. – 1986. – Vol. 118. – P. 206–207.

5. Naylor C. J. Demonstration of a virulent subpopulation in a prototype live attenuated turkey rhinotracheitis vaccine. / C.J. Naylor, & R.C. Jones // Vaccine. – 1994. – Vol. 12. – P. 1225–1230.

6. Patnayak, D.P. Growth of vaccine strains of avian pneumovirus in different cell lines / D.P. Patnayak, A. Tiwari, S.M. Goyal // Avian Pathol. – 2005. – Vol. 34. – P.123–126.

7. Picault J.P. Isolation of a TRT-like virus from chickens with swollen head syndrome / J.P. Picault, Giraud P. Drouin [et al.] // Vet. Rec. – 1987 – Vol. 121. – P. 135.

8. Wilding, G.P. Ciliostatic agent found in rhinotracheitis / G.P. Wilding, C. Baxter-Jones, M. Grant // Vet. Rec. – 1986. – Vol. 118. – P. 735.

Метапневмовирусы, как и другие биологические объекты, обладают свойствами, передаваемыми по наследству. Наряду со свойствами, общими для всех вирусов, имеются признаки, которые могут быть выражены в разной степени у вариантов одного и того же вируса. Эти свойства, играющие основную роль в дифференциации штаммов (вирусов), носят название генетических признаков.

Так как генетические признаки являются отражением особенностей вирусного генома, изменение их может служить показателем эффективности различных экспериментальных воздействий на генетический материал вируса, включая химический и физический мутагенез.

Установлено, что вирулентные и аттенуированные штаммы вируса могут различаться по ряду генетических признаков, тщательное их изучение приобрело особое значение для отбора природно-ослабленных и искусственно полученных вакцинных вариантов.

Усовершенствование имеющихся методов контроля и научно-практическая разработка новых методов контроля вакцинных штаммов метапневмовируса птиц в процессе изготовления и применения вакцин против этой болезни, как и других биопрепаратов, должно складываться из следующих основных направлений:

а) применение современных методов оценки производственных штаммов, характеризующих их иммунобиологические особенности – детальная проверка генетических признаков, их вариабельности в организме и в культурах клеток;

б) применение высокочувствительных и стабильных клеточных культур, не содержащих контаминирующих агентов для контролей производственных штаммов и вакцин;

в) использование иммунных типоспецифических сывороток (не гипериммунных и не гамма-глобулинов) для типирования производственных штаммов и эталонов для контроля иммуногенной и антигенной активности производственных серий вакцин.

Целью настоящей работы явилось изучение генетических маркеров вакцинных штаммов метапневмовируса птиц, связанных с особенностями их внутриклеточной репликации и выявляемых in vitro.

Материалы и методы исследований

При выполнении работы использовали вакцинные штаммы 8544 подтипа А (G.P Wilding et al., 1986) [8] и VC-03 подтипа В (Y.P. Picault et al., 1987) [7] МПВ птиц, культивируемые в клетках Vero.

Эксперименты ставили на первично-трипсинизированных культурах фибробластов СПФ эмбрионов кур (ФЭК), эмбрионов гусей (ФЭГ), трахеальной органной культуре (ТОК) куриных эмбрионов, перевиваемой линии клеток Vero (институт гриппа АМН, Санкт-Петербург).

Культивирование культур клеток проводили с использованием питательных сред Игла МЕМ и/или ДМЕМ и № 199, растворов версена 0,02 %, Хенкса фирмы «Hyclone, раствора трипсина 0,25 % фирмы «US BIO производства ООО «Биолот, Санкт-Петербург, сыворотки крови крупного рогатого скота и плодов коровы.

Приготовление культуры клеток, титрование вируса по цитопатогенному действию, изучение маркеров штаммов проводили по методам, описанным в руководстве по вирусологии [3].

Способность штаммов вируса к репликации в культуре клеток при различных температурах определяли по методу М. Беньеш-Мельник, Дж. Л. Мельник (1961) [1], в основе которого лежит вычисление разности между титрами штаммов вируса при температуре 37 и 34 °С или 37 и 40 °С.

Результаты исследований и их обсуждение

Репликация вакцинных штаммов 8544 и VC-03 МПВ птиц в культуре ФЭК сопровождалась цитопатическим эффектом с первого пассажа, и этот феномен обнаруживался через 48–72 часа после инокуляции клеток. В культуре ФЭУ и ФЭГ штаммы вируса адаптировались со 2–3 пассажа. Штаммы 8544 и VC-03 индуцировали острую форму вирусной инфекции в первичных культурах различным латентным периодом в зависимости от вида культуры клеток.

Характер цитопатогенного действия (ЦПД) выражался в округлении клеток с зернистостью в цитоплазме на ограниченных участках монослоя через 48–72 часа. На 4–5 сутки инкубации зернистость наступала по всему монослою. Полную дегенерацию и гибель ФЭК отмечали на 6–7 сутки и 8–9 сутки ФЭУ и ФЭГ после инфицирования с образованием разной величины синцитиальных формаций.

Данные, приведенные в табл. 1, показали, что в культуре ФЭК вакцинные штаммы 8544 и VC-03 накапливались в 5-ом пассаже в титрах 5,25 ± 0,2 и 5,75 ± 0,1 lg ТЦД₅₀/см3 соответственно. В культурах ФЭУ титры были 2,75 ± 0,3 и 3,1 ± 0,3 lg ТЦД₅₀/см3 и ФЭГ – 3,0 ± 0,2 и 3,7 ± 0,1 lg ТЦД₅₀/см3.

Данные, представленные в табл. 2, показали, что вакцинные штаммы 8544 и VC-03 имели максимальное накопление 6,25 ± 0,1 и 6,75 ± 0,1 lg ТЦД₅₀/см3 соответственно, в клетках Vero с посевной концентрацией 2×10⁵ кл/см3 при инокуляции монослоя через 48–72 ч и времени съема вируса через 72 ч после заражения.

При микроскопическом изучении клеток Vero, инфицированных вакцинными штаммами МПВ птиц, отмечали характерные аналогичные цитопатические изменения в монослое и структуре клеток через различные сроки после инокуляции.

Таблица 1

Инфекционные титры вакцинных штаммов МПВ птиц в первично-трипсинизированных культурах клеток (n = 5)

Библиографическая ссылка