Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,653

TOWARDS THE PHYSICAL PRINCIPLES OF THE BIOLOGICAL EVOLUTION

Brilkov A.V. Loginov Y.Y. Loginov I.A. Brilkova E.V. Zolotov O.A. Dubich V.V.
В экспериментах по микроэволюции генетически модифицированных бактерий (ГМО) при непрерывном культивировании показано, что при переходе от одного стационарного состояния к другому в открытой биологической системе скорость производства энтропии должна возрастать, а не уменьшаться, как следует из основных положений неравновесной термодинамики. С точки зрения термодинамики проточные культуры микроорганизмов – хемостат и турбидостат – это открытые термодинамические системы, способные находиться в устойчивых стационарных состояниях. Причем, в соответствии с классификацией М.Эйгена (1973), хемостат соответствует случаю постоянных потоков, а турбидостат – случаю постоянной организации. Несмотря на кажущееся разнообразие микроэволюционных переходов в двух типах открытых систем при их изучении обнаруживаются общие закономерности. Важнейшей из них является возрастание потока использованной популяциями свободной энергии, и, следовательно, возрастание теплорассеяния и скорости производства энтропии. Результаты свидетельствуют о необходимости дальнейшего развития термодинамической теории открытых биологических систем, дальнейшего изучения общих закономерностей биологического развития.
Our observations of the experimental evolution of genetically modified bacterial strains (GMO) during continuous cultivation indicate that the entropy production rate should increase in open biological system, in controversy with the general principles of the non equilibrium thermodynamics. From the point of view of thermodynamics a microbial continuous cultures – the chemostat and the turbidostat – are open thermodynamic systems able to stay in stable steady states. According to the M. Eigen(1973) classification, the chemostat corresponds to the case of constant flows (constant dilution rate), whereas the turbidostat – to the case of constant organization (constant population density). As follows from the Prigogine’s minimum entropy production theorem the entropy production rate should decrease in the processes of the steady states evolution in open systems of both types. However the flow of free energy used by open biological systems of both types increases in this case, consequently, the heat-dissipation which characterizes the entropy production rate should also increase. So, the necessity of the further development of the thermodynamic theory of open biological systems and the implementation of physical principles of the biological evolution is obvious. Keywords: thermodynamics; Prigogine’s minimum entropy production theorem; open biological systems; experimental evolution; genetically modified organisms (GMO); continuous culture; chemostat, turbidostat

Статья представляет собой краткий обзор подходов кразработке физических принципов биологической эволюции. Показано, что впроцессе экспериментальной эволюции генетически модифицированных микроорганизмов (ГМО) воткрытой биологической системе скорость производства энтропии должна возрастать, ане уменьшаться, как следует из основных положений неравновесной термодинамики. Сточки зрения термодинамики, непрерывные культуры микроорганизмов - это открытые термодинамические системы, способные находиться вустойчивых стационарных состояниях. Всоответствии склассификацией М.Эйгена (1973), хемостат соответствует случаю постоянных потоков (постоянная скорость разбавления среды), вто время как турбидостат - случаю постоянной организации (постоянная плотность популяции микроорганизмов). Как следует из общих принципов неравновесной термодинамики (теорема Пригожина) открытые системы обоих типов встационарном состоянии должны эволюционировать внаправлении снижения скорости производства энтропии. Наши наблюдения экспериментальной эволюции микроорганизмов, втом числе иГМО, при непрерывном культивировании вхемостате итурбидостате противоречат этому. Результаты экспериментов свидетельствуют онеобходимости дальнейшего развития термодинамической теории открытых биологических систем, дальнейшего изучения общих закономерностей биологического развития.

Непрерывные культуры микроорганизмов. Вначале 50-хгодов прошлого века были обоснованы истали широко применяться вэкспериментах два типа непрерывного (проточного) культивирования микроорганизмов - спостоянным протоком питательной среды через культиватор (хемостат) ипостоянной оптической плотностью суспензии микроорганизмов вкультиваторе (турбидостат) [1, 2, 3].

pic

Рис. 1. Принципиальные особенности
двух типов непрерывной культуры
микроорганизмов - хемостата итурбидостата (рН-стата)

Принципиальные особенности двух типов непрерывной культуры микроорганизмов - хемостата итурбидостата - приведены на рис.1 (изображен распространенный вариант турбидостата - рН-стат). Вхемостате это - постоянный проток питательной среды судельной скоростью разбавления D, втурбидостате - постоянство плотности популяции микроорганизмов, которое обеспечивается регулировкой скорости разбавления среды. Спомощью технических следящих устройств свежая питательная среда подается со скоростью, равной скорости прироста популяции. Поясним разницу на распространенной математической модели непрерывной культуры Моно-Герберта [4]:

f
f(1)

μ=μmS/(Ks+S),

где X - плотность популяции микроорганизмов; S0, S - концентрация субстрата во входной среде ивкультиваторе; μ - удельная скорость роста популяции; Y - коэффициент экономичности использования субстрата; функция μ=μ(S)=μmS/(Ks+S) - зависимость удельной скорости роста популяции микроорганизмов от концентрации субстрата выбрана внаиболее распространенной форме записи по Моно ввиде кривой снасыщением; Ks - константа полунасыщения; μт - константа максимальной скорости роста популяции.

В хемостате D=const ипри μ(S)=D из уравнений (1) можно найти стационарные значения Х иS соответственно:

X*=Y (S0 - S*), (2)

S*=Ks D(μт - D).

В отличие от хемостата, втурбидостате экспериментатором задается постоянная плотность популяции микроорганизмов X0=const, аудельная скорость разбавления D определяется уравнением регулятора, например, всамом простейшем случае, линейного типа:

D=k(X - X0), (3)

где Х0 - заданная плотность популяции; k - постоянная регулирования, k>0.

Стационарные значения фактической плотности популяции микроорганизмов иконцентрации субстрата вкультиваторе втурбидостате при выполнении равенства μ(S)=D следующие:

X*=μ(S*)/k + X0, (4)

S*=S0 - X*/Y.

Из выражений (4) следует, что встационарном состоянии втурбидостате срегулятором линейного типа, задаваемым уравнением (3), устанавливается плотность популяции микроорганизмов X* несколько выше необходимого экспериментатору значения Х0 - на малую величину ε=μ(S*)/k. При использовании регуляторов других типов действительная плотность популяции X* может быть инемного меньше задаваемого значения Х0.

Турбидостатные методы культивирования технически сложнее ииспользуются реже, большей частью благодаря тому, что они позволяют исследовать разнообразные ограничения роста популяций микроорганизмов, поскольку при ограничении роста популяции микроорганизмов внешним ингибитором хемостат неустойчив [4]. Вэкологических исследованиях турбидостат обычно соответствует росту популяций внелимитированных по ресурсам условиях, что вприроде может встречаться на ранних фазах экологической сукцессии, например, при заселении новой экологической ниши. Непрерывное культивирование вхемостате сглубоким лимитированием роста субстратом является аналогом большинства природных ситуаций, где встречается ограничение роста недостатком питательных веществ, витаминов, элементов или микроэлементов. Очевидно, что при использовании достаточно точного регулятора плотности популяции втурбидостате или его аналогах (уравнение (3)) можно впринципе задать любую степень лимитирования роста популяции микроорганизмов недостатком определенного субстрата, т.е. так же, как ивхемостате. Однако закономерности микроэволюции микробных популяций при длительном развитии вэтих двух типах открытых систем, как мы увидим ниже, отличаются.

«Экспериментальные эволюционные машины» [1, 4-6]. Здесь необходимо подчеркнуть два важных свойства турбидостата ихемостата. Сточки зрения функционирования открытых систем хемостат итурбидостат - это термодинамические системы, способные находиться вустойчивых стационарных состояниях. Причем, всоответствии склассификацией М.Эйгена, хемостат соответствует случаю постоянных потоков, атурбидостат - случаю постоянной организации (или постоянных реакционных сил). Несмотря на кажущееся кинетическое разнообразие эволюционных переходов вэтих двух типах открытых систем, при их изучении обнаруживаются общие закономерности, прежде всего, возрастание потока использованной популяцией энергии Нисп (рис.2). Энергетический подход кописанию общих закономерностей биологической эволюции на различных уровнях организации биологических объектов был разработан втрудах А.Лотки, Х.Моровица, Г.Одума, Н.С.Печуркина идр. [6-10]. Недавно эти представления были развиты иобобщены Н.С.Печуркиным ввиде энергетических принципов биологической эволюции [6]. Первый принцип экстенсивного развития заключается вмаксимизации впроцессе эволюции потока внешней энергии, используемой популяцией, второй принцип интенсивного развития устанавливает максимум потока используемой энергии на единицу биологической структуры [6].

pic

Рис. 2. Снижение стационарной («остаточной») концентрации субстрата, лимитирующего рост популяции микроорганизмов, впроцессе микроэволюции при длительном непрерывном культивировании вхемостате (схема)

Эволюция самовоспроизводящихся молекулярных структур типа гиперциклов (замкнутых цепочек из ферментов инуклеиновых кислот) вдвух типах открытых систем изучалась М.Эйгеном [11]. Он рассматривал конкуренцию гиперциклов воткрытых системах при двух типах селекционных ограничений: постоянные потоки (аналог хемостата) ипостоянная организация (аналог турбидостата). Близость его результатов красчетам по кинетике эволюционных переходов вмикробных популяциях оказалась удивительной [12]. Если же дополнить расчеты, введя поток богатых энергией мономеров, которые служат источником энергии ивещества для синтеза полимеров, то выполнение энергетического принципа экстенсивного развития Н.С.Печуркина становится совершенно очевидным для обоих случаев селекционных ограничений. Рассмотрим этот случай подробнее, поскольку он изучен лучше.

В соответствии склассификацией М.Эйгена [6], экспериментальной эволюционной системой, соответствующей случаю постоянных потоков, является хемостат, вкотором развивается генетически неоднородная популяция микроорганизмов. Для хемостата основное условие - это постоянство скорости разбавления среды: D=const.

Запишем систему уравнений для развития некоторой i-й мутантной популяции микроорганизмов Xi вхемостате, пренебрегая потоком обратных мутаций (см. схему на рис.2):

f

f (5)

μimax,i S/(Ks,i+S),

где Xi - плотность i-й мутантной популяции микроорганизмов; µi - удельная скорость размножения i-й мутантной популяции микроорганизмов; D - удельная скорость разбавления среды; S - концентрация субстрата вкультиваторе; S0 - концентрация субстрата всреде на входе вкультиватор; Yi - коэффициент экономичности использования субстрата микроорганизмами; K S,i, µmax, i - константы Моно для i-й мутантной популяции микроорганизмов.

Для стационарного состояния i-й мутантной популяции Xi, имеем следующие решения:

Xi*=Yi(S0 - Si*), (6)

Si*=K s,i D/(μ тax,i - D).

Анализ оказывает, что стационарное состояние i-й мутантной популяции (Xi*, Si*) устойчиво по Ляпунову иглобально устойчиво втом случае, если Si* является наименьшей стационарной концентрацией лимитирующего рост субстрата по сравнению саналогичными концентрациями для всех других популяций, включая исходную ивсевозможные мутантные [13, 14].

Это означает, что данная i-я мутантная популяция Xi выигрывает вконкуренции за субстрат увсех остальных иустойчиво существует вхемостате до тех пор, пока не появится некоторая другая мутантная форма Xk, стационарная концентрация субстрата Sk* для которой будет еще меньше: Sk*<Si*. Таким образом, появление мутантов сповышенной скоростью роста вхемостате всегда приводит кснижению стационарной концентрации лимитирующего рост субстрата Si*.

Типичная схема микроэволюционных переходов вмикробных популяциях, развивающихся вхемостате слимитированием роста по субстрату, выглядит следующим образом (см. рис. 2, см. также [1, 4, 5]). При появлении, более активного мутанта будет происходить переход кеще более низкой стационарной величине Si*, и, таким образом, можно наблюдать эволюцию стационарных состояний. При постоянстве D (условие хемостата) будет возрастать степень использования субстрата, т.е. снижаться остаточная, неиспользованная концентрация лимитирующего рост субстрата. Иными словами, будет возрастать его использованная доля, и, таким образом, для хемостата как термодинамической системы спостоянными потоками выполняется энергетический принцип экстенсивного развития Н.С.Печуркина - поток энергетического субстрата возрастает впроцессе микроэволюции [6].

Микроэволюционные переходы втурбидостате относятся пока кменее изученным, иэкспериментально, итеоретически. Поскольку втурбидостате поддерживается постоянной плотность популяции X0=const, то при неизменной концентрации субстрата на входе S0 изменение экономичности использования субстрата Yi умутантной популяции должно, впринципе, привести кизменению стационарной концентрации субстрата Si* втурбидостате (ее еще называют «остаточной» концентрацией субстрата). Следовательно, при этом должна измениться иудельная скорость роста исходной имутантной популяций, благодаря чему создается селективное преимущество мутантной формы по сравнению сисходной.

Анализ математической модели микроэволюции для турбидостата (выражения (1), (3), (5)) показывает, что остаточная концентрация субстрата упопуляции мутанта, заместившего исходную популяцию втурбидостате, не всегда минимальна. Таким образом, классические хемостатные критерии микроэволюции иконкурентоспособности популяций, основанные на снижении остаточной концентрации субстрата или большем наклоне зависимости m(S) упопуляции, выигравшей вконкуренции, втурбидостате не работают [4]. Более общим критерием микроэволюции идля хемостата, идля турбидостата является возрастание потока энергетического субстрата Нисп, использованного популяцией, победившей вконкуренции [14].

Термодинамические критерии эволюции. Физические принципы эволюции открытых термодинамических систем (теорема Пригожина, принцип Онзагера) противоречат развитию реальных живых систем, которые всвоем развитии явно увеличили ирассеяние, ииспользование потоков энергии, поглощаемых из окружающей среды [6-12, 15-20]. Направление эволюции стационарных состояний воткрытых системах всоответствии стеоремой И.Пригожина, как показано ниже, не соответствует наблюдаемому вэкспериментах странсгенными микроорганизмами пути эволюции этих состояний.

Известно, что существование общих термодинамических критериев эволюции биологических систем как открытых систем вдали от равновесия само по себе вызывает сомнения [15-17]. Экспериментальные измерения скорости образования энтропии биологической системы впринципе можно сделать по скорости теплопродукции при необратимых изменениях всистеме. Конечно, необходимо учитывать, что теплопродукция организмов зависит иот состояния мембранных структур, иот состояния энергетического метаболизма ит.д. [15]. Этим требованиям вполне отвечают стационарные состояния внепрерывной культуре микроорганизмов, вособенности микроэволюционные переходы, связанные спроцессами перестройки генетической структуры популяции, такие как, например, потеря плазмид клетками генетически модифицированных микроорганизмов (ГМО), без изменения типа исостояния энергетического метаболизма клеток.

К настоящему времени хорошо известно, что трансгенные штаммы бактерий, содержащие клонированные гены всоставе плазмид, легко теряют плазмиды ибыстро замещаются бесплазмидными вариантами при культивировании впроточных условиях внепрерывной культуре (в хемостате или турбидостате). Потерю признака, детерминируемого клонированными вплазмидах генами, вэтих процессах микроэволюции трансгенных плазмидсодержащих бактерий легко наблюдать вэкспериментах [21]. Удельная скорость размножения бесплазмидных вариантов значительно превышает аналогичную уплазмиднесущих бактерий, вынужденных расходовать дополнительные энергетические ресурсы на обеспечение функции клонированных вплазмидах генов. Показано, что удельная скорость теплопродукции популяции микроорганизмов внепрерывной культуре прямо пропорциональна удельной скорости роста, или, вболее общем случае, - потоку энергетического субстрата, использованного популяцией [22, 23].

Следовательно, при переходе от одного стационарного состояния кдругому впроцессе микроэволюции микробных популяций воткрытой системе удельная скорость теплопродукции, а сней искорость прироста энтропии, по-видимому, должна возрастать, ане уменьшаться, как полагают М.Эйген [11], Г.Николис иИ.Пригожин [18], В.Эбелинг [19], А.И.Зотин ссоавт. [20] идругие исследователи. Очевидное противоречие физических принципов развития открытых биологических систем иколичественных критериев, основанных на экспериментах спроточными популяциями микроорганизмов, нуждается вэкспериментальном подтверждении. Соответствующая проверка была проведена нами вэкспериментах на примере микроэволюции трансгенных штаммов бактерий (ГМО).

Эксперименты по микроэволюции трансгенных бактерий (ГМО) воткрытых системах. Вэкспериментах изучали микроэволюцию трансгенных плазмидсодержащих штаммов бактерий Escherichia coli MG1655, связанную спотерей признака, детерминируемого генами, клонированными вплазмидах, при длительном непрерывном культивировании вpH-стате (аналог турбидостата).

Для удобства наблюдения микроэволюционных переходов впопуляции микроорганизмов использовались бактерии Escherichia coli MG1655 (pGLO), (Ap, GFP), сплазмидами, содержащими клонированные гены зеленого флуоресцентного белка GFP. Плазмида pGLO, содержащая ген GFP сконструирована влаборатории Biorad (США), уровень экспрессии клонированных генов легко контролируется спомощью флуориметра. Долю мутантных клеток впопуляции бактерий, потерявших маркерный признак флуоресценции, легко наблюдать после высева на чашки Петри сагаризованной средой, либо непосредственно всамой пробе при микроскопировании [24]. Штамм Escherichia coli MG1655 (pGLO), (Ap,GFP) любезно предоставлен проф. Б. Левином (университет Эмори, Атланта, США), содержит клонированный ген зеленого флуоресцентного белка GFP под контролем арабинозного промотора. Таким образом, уровень экспрессии GFP зависит от концентрации арабинозы всреде [24].

Определяя селективное преимущество бесплазмидных штаммов, можно оценить давление отбора против плазмидсодержащих штаммов популяции бактерий сопределенным уровнем экспрессии (выражения) признака. Одновременно встационарном состоянии определяется скорость потребления энергетического субстрата, вданном случае арабинозы, которая характеризует энергетическую стоимость поддержания признака, детерминируемого плазмидными генами трансгенных бактерий.

f

Рис. 3. Замещение исходной плазмидсодержащей популяции трансгенных бактерий Escherichia coli MG1655 (pGLO), (Ap,GFP) бесплазмидной популяцией при длительном непрерывном культивировании вpH-стате (турбидостате). I - доля плазмидсодержащих ибесплазмидных клеток впопуляции бактерий, %;
II - динамика плотности популяции (приведена концентрация биомассы, г/л);
III - возрастание стационарной («остаточной») концентрации субстрата втурбидостате впроцессе замещения, г/л; IV - возрастание удельной скорости разбавления среды, ч -1;
V - возрастание потока энергетического субстрата (арабинозы), использованного популяцией бактерий, Hисп, г/г час

Типичные экспериментальные данные по микроэволюционным переходам вpH-стате (турбидостате) приведены на рис.3 (замещение исходного плазмидсодержащего штамма бактерий Escherichia coli MG1655 (pGLO), (Ap,GFP) бесплазмидной популяцией при длительном непрерывном культивировании). Результаты экспериментов свидетельствуют отом, что:

1)впроцессе микроэволюции популяции плазмидсодержащих трансгенных бактерий втурбидостате происходит возрастание стационарной (остаточной) концентрации субстрата S* (см.рис. 3);

2)впроцессе микроэволюции популяции трансгенных плазмидсодержащих бактерий втурбидостате, также как ивхемостате (см. рис.2), возрастает поток использованного популяцией бактерий энергетического субстрата (Нисп).

Таким образом, внешний поток свободной энергии, используемый открытой биологической системой, вданном случае, популяцией трансгенных бактерий, а сним итеплорассеяние возрастает впроцессе ее эволюционного развития. Следовательно, скорость прироста энтропии также должна возрастать при самопроизвольном переходе от одного стационарного состояния кдругому впроцессе микроэволюции, ане уменьшаться, как это следует из основных положений неравновесной термодинамики (см. например, [11, 15-20]).

Проведенное внастоящей работе экспериментальное изучение микроэволюционных переходов впопуляции трансгенных бактерий (ГМО), связанных спотерей признаков, детерминируемых клонированными генами, требует дальнейшего развития термодинамической теории открытых биологических систем, уточнения физических принципов биологической эволюции.

Исследования по изучению закономерностей микроэволюции трансгенных бактерий (ГМО) проводятся при поддержке ФЦП «Научные инаучно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013г., проект НК-550П/2.

Список литературы

  1. Gitelzon I.I., Pechurkin N.S., Bril´kov A.V. Population Problems in the Biology of Unicellular Organisms. - London: Harwood Academic Publ. GmbH (United Kingdom), 1989. - P. 1-77.
  2. Monod J. La technique de culture continue. Theorie et applications // Ann. Inst. Past. - 1950. - Vol. 79. - Р. 390-410.
  3. Novick A., Szilard L. Description of the chemostat // Science. - 1950. - Vol. 112. - Р. 715-718.
  4. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология. - Новосибирск: Наука, 1978. - С. 1-278.
  5. Wick L.M., Weilenmann H., Egli T. The apparent clock-like evolution of Escherichia coli in glucose-limited chemostats is reproducible at large but not at small population sizes and can be explained with Monod kinetics // Microbiology. - 2002. - Vol. 148. - C. 2889-2902.
  6. Печуркин Н.С. Энергетические аспекты развития надорганизменных систем. - Новосибирск: Наука, 1982. - С. 1-113.
  7. Pechurkin N.S. Quantitative criteria for estimation of natural and artificial ecosystems functioning // Adv. Space Res. - 2005. - Vol. 35, №9. - P. 1507-1511.
  8. Hannon Bruce. The role of input-output analysis of energy and ecologic systems / Bruce Hannon // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2010. - Vol. 1185. - P. 30-38.
  9. Morowitz Harold J., Smith Eric. Energy flow and the organization of life / Harold J. Morowitz, Eric Smith // Complexity. - 2007. - Vol. 13, №1. -. P. 51-59.
  10. Odum Howard T. Environment, power, and society for the twenty-first century: the hierarchy of energy / Howard T. Odum. - N.Y. e. a.: Columbia University Press, 2007. - P. 1-418.
  11. Эйген М. Самоорганизация материи иэволюция биологических макромолекул. - М.: Мир, 1973. - С. 1-216.
  12. Печуркин Н.С., Никифорова Н.В., Дегерменджи А.Г. Сравнительный анализ эволюции гиперциклов Эйгена имикробных популяций воткрытых системах // Биофизика. - 1982. - Т. 27, №2. - С. 297-303.
  13. Hsu S.B., Hubbell S.P., Waltman P.A mathematical theory for single-nutrient competition in continuous cultures of microorganisms // SIAM J. Appl. Maths. - 1977. - Vol. 32. - Р. 366-383.
  14. Brilkov A.V., Bogucharov A.A. Energetic principles of autoselection in microorganisms continuous culture // Abstr. 9th ISCC. - Hradec Kralove (CSSR), 1987. - Р. 8.
  15. Рубин, А. Б. Термодинамика биологических процессов // Сорос. образов. журн. - 1998. - №10. - С. 77-83.
  16. Мартюшев Л.М. Принцип максимальности производства энтропии вфизике исмежных областях / Л.М. Мартюшев, В.Д. Селезнев. - Екатеринбург: ГОУ ВПО УГТУ-УПИ, 2006. - 83 с.
  17. Axel Kleidon, Yadvinder Malhi and Peter M. Cox. Maximum entropy production in environmental and ecological systems // Phil. Trans. R. Soc. B. - 2010. - Vol. 365. - P. 1297-1302.
  18. Николис Г., Пригожин И. Самоорганизация внеравновесных системах: от диссипативных структур купорядоченности через флуктуации. - М.: Мир, 1979. - C. 1-512.
  19. Эбелинг В., Энгель А., Файстель Р. Физика процессов эволюции. - М.: Эдиториал УРСС, 2001. - С. 1-328.
  20. Зотин А.И., Зотин А.А. Направление, скорость имеханизмы прогрессивной эволюции: Термодинамические иэкспериментальные основы. - М.: Наука, 1999. - С. 1-320.
  21. Ganusov V.V., Brilkov A.V. Estimating the instability parameters of plasmid-bearing cells. I. Chemostat culture // Journal of Theoretical Biology. - 2002. - Vol. 219, № 2. - Р. 193-205.
  22. Ishikawa Y., Shoda M. Calorimetric Analysis of Escherichia coli in Continuous Culture// Biotechnology and Bioengineering. - 1983. - Vol. 25. - P. 1817-1827.
  23. Brettel R., Corti L., Lamprecht I., Schaarschmidt B. Combination of a continuous culture with a flow-microcalorimeter // Studia biophysica. - 1972. - B. 34, H. 1. - S. 71-75.
  24. Siegele D.A., Hu J.C. Gene expression from plasmids containing the araBAD promoter at subsaturating inducer concentrations represents mixed populations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - Vol. 94. - Р. 8168-8172.