Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,653

ANALYSIS OF ATP-DEPENDENT AND CALCIUM MECHANISMS IN IMPLEMENTATION NEUROTROPIC ACTION OF ASPIRIN AND ITS DERIVATIVES

Cheretaev I.V. 1 Koreniuk I.I. 1 Khusainov D.R. 1 Gamma T.V. 1 Katiushina O.V. 1 Kolotilova O.I. 1
1 Taurida National University Vernadsky
Статья посвящена исследованию механизмов нейротропного действия аспирина, ацетилсалицилатов кобальта и цинка. Показано, что наличие аденозинтрифосфата во внеклеточном пространстве существенно модифицирует нейротропные эффекты салицилатов. Сочетанное приложение аденозинтрифосфата с аспирином устраняет угнетение импульсной активности нейронов, вызванное индивидуальным раствором этого препарата, а совместная экспозиция аденозинтрифосфата с ацетилсалицилатами кобальта и цинка, наоборот, усиливает их активирующие эффекты. При блокировании CdCl2 и BaCl2 поступления Са2 + в нейроплазму из внеклеточной среды и внутриклеточных депо выявлено, что кальциевые механизмы не участвуют в нейротропных эффектах исследуемых салицилатов.
The article is sanctified to research of mechanisms of neurotropic action aspirin, acetylsalicylates of cobalt and zinc. It is showed that the presence of adenosinetriphosphate in an extracellular environment substantially modifies the neurotropic effects of salicylates. Joint application of adenosinetriphosphate with aspirin removes oppressing of impulsive activity of neurons, caused by the action of this drug, and the joint display of adenosinetriphosphate with acetylsalicylates of cobalt and zinc, vice versa, strengthens the activating effects of these salts. At the blockade CdCl2 и BaCl2 of potential dependent membrane Са2+-current and their excretions from a intracellular depot showed, that calcium mechanisms did not participate in the neurotpopic effects of aspirin and his salts.
aspirin
calcium
adenosinetriphosphate
neurotropic action

Установлено, что аспирин (Аsp) и его комплексные производные – ацетилсалицилаты кобальта (АСК) и цинка (АСЦ) способны изменять электрические потенциалы нейронов ЦНС [1, 2]. Ранее нами было показано [6], что нейротропное действие салицилатов может реализовываться с участием циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ), а роль других вторичных посредников в его механизме ещё не ясна. Есть лишь сведения о том, что Аsp и его производные угнетают синтез аденозинтрифосфата (АТФ) [3], однако это явление не связывают с нейротропными эффектами салицилатов. Известно, что в нейронах АТФ используется для работы ионных насосов и каналов и способен дефосфорилироваться до цАМФ – мессенджера аденилатциклазного каскада передачи сигналов внутрь клетки и агониста P2-рецепторов ионных каналов, а продукт его распада – аденозин – регулирует деятельность P1–рецепторов [4, 12]. Вышеизложенное позволяет предположить, что механизм нейротропного действия Аsp и его производных может в значительной степени определяться изменением вне- и внутриклеточной концентрации АТФ. Обращает внимание и отсутствие в литературе данных о роли Са2+ в эффектах салицилатов, хотя известно, что эти ионы могут влиять на возбудимость нейронов и внутриклеточные процессы в них, в том числе и связанные с циклическими нуклеотидами [11].

Таким образом, целью этой работы явилось изучение роли АТФ-зависимых и кальциевых механизмов в реализации нейротропного действия Аsp и его производных – АСК и АСЦ.

Материалы и методы исследования

Исследования проведены на 159 неидентифицированных нейронах висцерального и правого париетального ганглиев улитки Helix albescens Rossm. Для этого окологлоточное нервное кольцо препарировали из тела улитки, фиксировали в экспериментальной камере (объём 0,5 мл) с постоянным протоком раствора Рингера для холоднокровных животных (NaCl – 100, KCl – 4, CaCl2 – 10, MgCl2 – 4, трис-HCl – 10, состав указан в миллимолях на 1 л; температура 18–21 °С, pH = 7,5) и удаляли наружные соединительнотканные оболочки [6, 9]. Затем проток раствора Рингера перекрывали и однократно апплицировали в объёме 1 мл разведённые им до необходимых концентраций вещества. В эксперименте использовали Аsp, BaCl2, CdCl2 («Merk», Германия), АТФ («Здоровье народа», Украина), АСК, АСЦ (синтезированы на кафедре общей химии Таврического национального университета им. В.И. Вернадского) с химической чистотой не менее 95 %. Электрические потенциалы нейронов регистрировали и записывали методом внутриклеточного отведения с помощью физиологической установки [6] и программы «Action Potential» [10] по схеме: фон (1 мин); экспозиция раствора тестируемого вещества – контроль (4 мин.); экспозиция того же вещества (4 мин) в сочетании с одним из агентов (АТФ, CdCl2, BaCl2); отмывание (20 мин). С помощью указанной программы рассчитывали амплитудно-временные характеристики потенциалов нейронов и оценивали скорость нарастания суммарных трансмембранных ионных токов [6]. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью критерия Вилкоксона.

Результаты исследования и их обсуждение

Нейротропные эффекты индивидуальных и сочетанных с аденозинтрифосфатом растворов аспирина, ацетилсалицилатов кобальта и цинка. В данной серии экспериментов были исследованы эффекты индивидуального и сочетанного с АТФ приложения во внеклеточную среду растворов Аsp, АСК, АСЦ. Концентрация каждого вещества в окружающем нейроны растворе составляла 5∙10–4 M. Такая концентрация является физиологической внутри клеток для АТФ [12], и именно в ней Аsp, АСК и АСЦ оказывают выраженное нейротропное действие [1, 2].

Приложение к наружной поверхности мембран нейронов (n = 8) индивидуального раствора АТФ в концентрации 5∙10–4 M не оказывало достоверного влияния на исследуемые параметры их электрической активности. В данном случае отсутствие эффектов объясняется тем, что дополнительные поступления АТФ разрушаются ферментами экто-АТФазами до аденозина [12].

Экспозиция индивидуального раствора Аsp (n = 11) в концентрации 5∙10–4 M приводила к характерному угнетению электрической активности нейронов: снижала частоту генерации импульсов (ЧГИ), уменьшала амплитуду потенциалов действия (ПД) и увеличивала негативность мембранного потенциала (МП) (рис. 1, а, 1–2). При этом на уровне тенденции снижалась скорость нарастания входящих и увеличивалась (p < 0,05) – скорость нарастания выходящих трансмембранных ионных токов (рис. 1, а, 3–4).

аpic_24.tifбpic_25.tifв

Рис. 1. Нейротропные эффекты индивидуальных и сочетанных с 5∙10–4 М аденозинтрифосфатом (АТФ) растворов аспирина, ацетилсалицилатов кобальта и цинка в концентрации 5∙10–4 М. Примечание: Аsp – аспирин, АСК – ацетилсалицилат кобальта, АСЦ – ацетилсалицилат цинка. Тестируемые растворы отмечены на диаграммах. Горизонтальной жирной линией обозначены значения фоновых показателей, принятые за 100 %; 1 – частота генерации импульсов, 2 – амплитуда потенциалов действия, 3 – скорость суммарных входящих ионных токов, 4 – скорость суммарных выходящих ионных токов, 5 – мембранный потенциал.1’ – 5’ – показатели электрической активности при сочетанной экспозиции салицилатов с АТФ. n – количество исследованных нейронов; * – p < 0,05, ** – p < 0,01 – достоверные изменения показателей контроля по сравнению с фоном; ■ – p < 0,05, ■■ – p < 0,01 достоверные изменения показателей эксперимента по сравнению с контролем

По сравнению с эффектами индивидуального раствора Аsp воздействие АК + АТФ (n = 11) увеличивало ЧГИ (p < 0,01) исследованных нейронов на 39,9 % (рис. 1, б, 1 и 1’). Таким образом, в присутствии АТФ угнетение ЧГИ, вызванное Аsp, нивелировалось. Это сопровождалось увеличением на уровне тенденции скорости нарастания суммарных входящих трансмембранных ионных токов и снижением – выходящих (рис. 1, а, 3–3’, 4–4’). Указанные изменения свидетельствуют о возрастании при действии АТФ и (или) продукта его распада – аденозина –проницаемости наружных мембран нейронов для Na+ и, возможно, Ca2+. Следует напомнить, что в плазматической мембране многих нейронов моллюсков Ca2+ -каналы отсутствуют, а добавление АТФ неспецифически нивелировало угнетающие эффекты Аsp у всех исследованных нейронов. Поэтому мы считаем, что повышение уровня внеклеточного АТФ приводило главным образом к активации Na+ -каналов. Раствор Аsp + АТФ на уровне тенденции также снижал и скорость нарастания суммарных выходящих ионных токов, что указывает на некоторое снижение проницаемости мембран для К+ (рис. 1, А, 4–4’). Это может быть связано с инактивацией АТФ-зависимого тока К+ [4].

Поскольку угнетающие нейротропные эффекты Аsp устранялись добавлением АТФ в окружающий нейроны раствор в количестве соответствующем его внутриклеточной физиологической концентрации, это даёт основание полагать, что механизм такого эффекта связан с нарушением синтеза АТФ на внутриклеточных мембранах нейронов и сокращением его выброса во внеклеточное пространство. Вызванный Аsp недостаток АТФ внутри и вне клеток может быть причиной снижения функциональной активности нейронов за счёт замедления скорости энергозависимых и опосредованных пуринэргической сигнализацией внутриклеточных процессов. Например, могла нарушаться электрогенная функция Na+–К+-насоса, активироваться АТФ-зависимый ток К+ [4].

Приложение растворов АСК и АСЦ достоверно повышало ЧГИ по сравнению с фоном, а добавление к этим агентам АТФ ещё больше увеличивало ЧГИ – на 19,2 и 26,8 % соответственно (p < 0,05; рис. 2, б и в, 1–1’). Растворы АСК + АТФ и АСЦ + АТФ достоверно (p < 0,01) уменьшали (рис. 1, б и в, 3’–4’) скорость нарастания суммарных выходящих ионных токов. Данные изменения свидетельствуют об ингибирующем действии АТФ на К+-каналы. Согласно данным [4], это может быть связано с инактивацией АТФ-зависимых К+-каналов, которые были обнаружены и в нейронах брюхоногих моллюсков. Кроме того, все протестированные соли в сочетании с АТФ на уровне тенденции увеличивали скорость нарастания суммарных входящих ионных токов (рис. 1, б-в, 3’), что согласно [6, 12] указывает на увеличение проницаемости натриевых и, возможно, кальциевых ионных каналов.

Не исключено, что усиление активирующих эффектов АСК и АСЦ при добавлении к ним АТФ может быть результатом и непосредственной активации тестируемыми солями синтеза АТФ на мембранах нейронов. В этом случае последовательность событий, происходящих в нейронах при воздействии растворов АСК + АТФ и АСЦ + АТФ, может быть следующей:

1. Под влиянием АСК, АСЦ происходит увеличение продукции АТФ на внутриклеточных мембранах и его выброса в наружную среду, а добавление АТФ во внеклеточную среду ещё больше увеличивает его содержание здесь.

2. Увеличение уровня АТФ выше физиологических концентраций может запускать последовательные реакции его дефосфорилирования экто-АТФазами и эктонуклеотидазами мембран [11]. Однако слишком большое количество АТФ, по-видимому, вызывает полное субстратное насыщение активных центров этих ферментов, разрушающих АТФ до аденозина.

3. Замедляется распад АТФ, вследствие чего он модулирует фукционирование ионных каналов, управляемых P2 рецепторами. Аденозин, образовавшийся в результате распада АТФ, может стимулировать процессы, опосредуемые P1 рецепторами.

Ранее нами было показано, что облегчающее и модулирующее влияние салицилатов на нейроны улитки опосредуется цАМФ [6], который является активатором/ингибитором различных подтипов P2 и P1 рецепторов [12]. В присутствии растворов АСК и АСЦ мы тоже наблюдали медленноволновые колебания МП, которые согласно [6] указывают на изменения концентрации цАМФ и цГМФ. Всё это свидетельствует в пользу предлагаемой нами выше схемы для объяснения эффектов сочетанного воздействия АТФ и солей Аsp, поскольку изменение концентрации цАМФ в нейронах может быть вызвано эффектами АТФ и аденозина [12], а в отношении самого Аsp известно, что он не только угнетает синтез АТФ, но и уменьшает содержание цАМФ [3]. Мы полагаем, что активирующие нейротропные эффекты АСК и АСЦ, в отличие от угнетающих Аsp, обусловлены увеличением синтеза АТФ и, следовательно, цАМФ. Если это так, то можно считать, что в механизме эффектов АСК и АСЦ значительную роль играют внеклеточный уровень АТФ и, по-видимому, его продукта – аденозина.

Нейротропные эффекты аспирина и его производных при блокаде входящего кальциевого тока хлоридом кадмия. Для выяснения роли входящего трансмембранного кальциевого тока в нейротропных эффектах Asp, АСК и АСЦ в серии экспериментов мы использовали его блокатор – CdCl2 [4, 5]. Как видно из рис. 2, эффекты приложения индивидуальных и сочетанных с CdCl2 растворов указанных веществ в концентрациях 5∙10–5 и 5∙10–4 М существенно не отличались.

аpic_25.tifб
вpic_26.tifг
дpic_27.tifе  

Рис. 2. Нейротропные эффекты приложения индивидуальных и сочетанных с CdCl2 растворов аспирина, ацетилсалицилатов кобальта и цинка. Примечание: концентрации веществ и CdCl2 в применяемых растворах 5∙10-5 (А, В, Д) и 5∙10-4 М (Б, Г, Е) Остальные обозначения те же, что и на рис. 1

Поскольку CdCl2 не изменял нейротропные эффекты тестируемых веществ, можно полагать, что они практически не связаны с входящим трансмембранным током Ca2+. Иными словами можно считать, что салицилаты не увеличивают проницаемость наружных мембран нейронов для Ca2+. Есть даже основания предполагать, что Аsp, АСК и АСЦ сами блокируют этот ионный ток.

Однако отсутствие поступления Ca2+ из внеклеточной среды в нейроплазму могло компенсироваться за счет выделения Ca2+ из внутриклеточных депо [11] и благодаря ингибированию Ca2+-АТФ-азы плазматических мембран (PMCA), которая способствует выведению Са2+ из клетки против градиента его концентрации, ионами Сd2+ [8]. Для того, чтобы выяснить, так ли это, в следующей серии экспериментов вместо хлорида кадмия мы апплицировали на мембраны нейронов хлорид бария – блокатор выделения Са2+ из внутриклеточных депо, входящего тока Са2+ и выходящего Са2+ -зависимого калиевого тока [4, 9]. Следует напомнить, что ионы Ва2+ не влияют на работу PMCA [8].

аpic_28.tifб
вpic_29.tifг
дpic_30.tifе

Рис. 3. Нейротропные эффекты приложения индивидуальных и сочетанных с BaCl2 растворов аспирина, ацетилсалицилатов кобальта и цинка. Примечание: концентрации тестируемых кислот и BaCl2 в используемых растворах 5∙10-5 (А, В, Д) и 5∙10-4 М (Б, Г, Е). Остальные обозначения те же, что и на рис. 1

Эффекты аспирина и его производных при блокаде хлоридом бария поступления ионов кальция в нейроплазму из наружной среды и внутриклеточных депо. Эффекты 5∙10–5 и 5∙10–4 М индивидуальных Аsp, АСК и АСЦ достоверно не отличались от их эффектов в сочетании с BaCl2 (рис. 3). Исключением было лишь снижение МП (p < 0,05) при действии 5∙10–5 М раствора Аsp + BaCl2 (рис. 3, а, 5–5’). Отмеченные изменения МП согласуются со сведениями литературы [4] о том, что BaCl2 может снижать МП. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в механизмах нейротропного действия тестируемых салицилатов ионы Са2+ не участвуют.

Однако следует учесть, что вызванное блокаторами уменьшение поступления Са2+ в нейроплазму может компенсироваться за счёт других механизмов. Например, Сd2+ и Bа2+ эффективно блокируют потенциалзависимые L и N каналы входящего кальциевого тока и не оказывают существенного влияния на Т каналы [4], хотя они и встречаются редко в мембранах нейронов моллюсков [7]. Другой путь поступления Са2+ в нейроплазму при действии салицилатов и BaCl2 может обеспечиваться благодаря работе Na+–Са2+ -обменников, при этом направление переноса Са2+ через наружную мембрану зависит от концентрации Na+ по обе её стороны [11]. При поступлении Na+ внутрь клетки, Na+–Са2+ -обменники способствуют выводу Na+ из клетки и накоплению в нейроплазме Са2+ из внеклеточной среды и внутриклеточных депо [11]. Это могло происходить и в присутствии Ва2+, обладающих меньшим сродством к внеклеточным сайтам Na+–Са2+ -обменников, чем Са2+ [8].

Выводы

1. Нейротропные эффекты аспирина, ацетилсалицилатов кобальта и цинка существенно зависят от содержания во внеклеточной среде АТФ. Механизм угнетающего нейротропного действия аспирина в значительной степени связан со снижением концентрации АТФ во внеклеточной среде, а активирующие эффекты ацетилсалицилатов кобальта и цинка усиливаются в присутствии АТФ.

2. Блокирование входящего тока и выделения Са2+ из внутриклеточных депо с помощью CdCl2 и ВаCl2 показало, что эти ионы не участвуют в реализации нейротропного действия аспирина, ацетилсалицилатов кобальта и цинка. Однако существуют другие механизмы поступления Са2+ в нейроплазму, которые не подвержены действию использованных нами блокаторов (функционирование Т-каналов входящего кальциевого тока, работа Na+–Са2+-обменников). Участие этих механизмов в нейротропном действии салицилатов ещё предстоит выяснить.