Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

Дисбиотические нарушения в настоящее время широко распространены в России и за рубежом. Особенно часто встречается дисбиоз кишечника, от которого, по данным различных исследователей, в той или иной степени страдает до 90 % населения страны [1]. Самым многочисленным как по видовому разнообразию, так и в количественном отношении является ассоциативный симбиоз микробных сообществ толстого кишечника [3]. У детей первого года жизни с высокой частотой и в этиологически значимых количествах выделяются клебсиеллы и золотистый стафилококк, что делает этот возраст уязвимым для развития эндогенных гнойно-воспалительных процессов различной локализации [2]. Микробиоценоз кишечника характеризуется неустойчивостью, связанной с микробной сукцессией при формировании микробиоты, особенностями иммунной системы, неадекватным иммунным ответом организма на заселение кишечника УПМ [1; 3]. Однако мало изученными остаются вопросы, связанные с распространенностью и взаимодействием генетических маркеров патогенности среди клебсиелл и стафилококков, персистирующих совместно в кишечном биотопе. Низкая эффективность эмпирического использования антибиотиков в сочетании с их побочным иммуносупрессивным эффектом приводит к подавлению нормальной микрофлоры кишечника и последующим формированием дисбиозов. Среди альтернативных антимикробных препаратов особый интерес представляют бактериофаги. В то время как антибиотики воздействуют на широкий спектр бактерий, в том числе и на нормальную микрофлору, бактериофаги обладают выраженной специфичностью [6].

Цель исследования. Оценить патогенный потенциал аутоштаммов Klebsiella spp. в ассоциации со Staphylococcus aureus, изолированных от детей первого года жизни с дисбиозами кишечника посредством детекции генетических детерминант патогенности.

Материалы и методы исследования

Были исследованы копрологические пробы 100 детей первого года жизни, у которых на основании микробиологических критериев был установлен дисбиоз кишечника с индикацией клебсиелл в диагностически значимых концентрациях (≥104 КОЕ/г) [8]. Исследуемая выборка была разделена на две группы: группа 1 – 60 детей, у которых аутоштаммы клебсиелл выделялись в монокультуре; группа 2 – 40 детей, у которых клебсиеллы вегетировали в ассоциации с золотистым стафилококком. Антибиотикорезистентность клебсиелл определяли диско-диффузионным методом [7]. Использовались антибиотические препараты (АБП) следующих групп: β-лактамы (амоксициллин, цефтазидим, ампициллин, цефотаксим), аминогликозиды (амикацин), хинолоны (норфлоксацин). Фагочувствительность определялась к коммерческим препаратам бактериофагов – «очищенному фагу клебсиелл пневмонии», «очищенному бактериофагу клебсиелл поливалентному» и «пиобактериофагу поливалентному» («Секстафаг») производства НПО «Микроген» г. Пермь. Тестирование проводилось согласно [4]. Бактериологический анализ содержимого толстой кишки производили согласно [8] и в соответствии с утвержденными методическими рекомендациями. Выделенные микроорганизмы идентифицировали общепринятыми методами [1]. Всего для ПЦР детекции факторов патогенности использовали 140 проб, где в группе 1 были типированы 60 проб с Klebsiella spp., а в группе 2 – по 40 проб Klebsiella spp. и Staphylococcus aureus. Для выделения ДНК бактерий из культуральной среды использовали комплект реагентов «ДНК-сорб-В» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Типирование проводили с шестью парами праймеров [2], отобранных согласно рекомендациям [5; 9; 10].

Для ПЦР-амплификации использовали коммерческий набор AmpliSens-200-1 (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). ПЦР проводили с ДНК-матрицы (3 мкл), прямого и обратного праймеров (1 мкл). ДНК амплифицировали в соответствии с протоколом [2]. Электрофорез ПЦР-фрагментов ДНК клебсиелл проводили с использованием 1,0 %-го агарозного геля в 1 % трис-ацетатном буфере в течение 60 мин при 100 В, окрашивали бромистым этидием (1%) и просматривали с помощью УФ-просвечивания. Выделенные гены были идентифицированы и определены на основе размера фрагмента ДНК продукта [2] при его соответствии с длиной маркерного фрагмента. Исследования проводились в течение 2012–2014 гг. Для статистической обработки результатов использовали Excel из пакета MS Office 2003.

Результаты исследования
и их обсуждение

В обследованной группе детей первого года жизни Klebsiella spp. была выделена в 60 % случаев, в том числе в ассоциации с золотистым стафилококком – в 40 %. Также был выявлен микроэкологический дисбаланс, который характеризовался дефи­цитом бифидобактерий (63,1±4,8), лактобацилл (6,8±2,5), нормальной кишечной палочки (11,7±3,2) на фоне высокой плотности бактерий рода Klebsiella (>104 КОЕ/г). В мазках 60 % аутоштаммов клебсиелл имели плотную полисахаридную капсулу, которая способствовала усилению гидрофобности клеточной стенки и препятствует проникновению фагов и АБП в клетку. Клебсиеллы чаще встречались в ассоциациях с Enterococcus spp. (78,6±4,1), Staphylococcus aureus (40,8±4,9); реже – с E. coli со слабой ферментативной активностью (26,2±4,4), Clostridium spp. (25,2±4,3) и грибами рода Candida (15,5±3,6). Далее по частоте убывания регистрировались E.coli с гемолитической активностью (13,6±3,4), коагулазонегативные виды стафилококка (4,9±2,2), Proteus spp. (3,0±1,7), Enterobacter spp. (2,0±1,4), Citrobacter frendii (2,0±1,4).

Установлено, что исследуемые штаммы клебсиелл (n=100) были чувствительны практически ко всем тестируемым антибиотикам. Процент штаммов чувствительных к β-лактамным антибиотикам составлял 85±3,5 % (цефтазидим), 83±3,8 % (амоксициллин), 89±3,1 % (цефотаксим). Исключение составил ампициллин, к которому были резистентны 70±4,5 % штаммов. Полученные данные подтверждают факт природной устойчивости клебсиелл к ампициллину. Также был высок процент штаммов чувствительных к амикацину и норфлоксацину (по 92±2,7 % случаев соответственно).

Результаты чувствительности штаммов Klebsiella spp. (n=156) к коммерческим препаратам бактериофагов представлены в табл. 1. 

Таблица 1

Характеристика чувствительности аутоштаммов Klebsiella spp к бактериофагам, (%)

Примечание. 0-1х – штамм нечувствителен; 2х – не более 50 отдельных негативных колоний; 3х – полусливной лизис со вторичным ростом; 4х – сливной лизис.

У аутоштаммов клебсиелл наблюдалась слабая чувствительность (0-1х) к бактериофагу поливалентному, фагу клебсиелл пневмоний и «Секстафагу» (66,0, 76,0 и 59,0 % штаммов соответственно). Средний уровень чувствительности (2х) штаммов клебсиелл регистрировался в 24,0 % случаев к бактериофагу поливалентному; в 40 % случаев к бактериофагу «Секста», что более, чем в два раза превышало частоту встречаемости штаммов, чувствительных к фагу клебсиелл пневмоний (16,0 % случаев). Высокий уровень чувствительности (3-4х) наблюдался у 10,0 % штаммов Klebsiella spp. к бактериофагу поливалентному, у 8,0 % штаммов к бактериофагу клебсиелл пневмоний, и всего лишь в 1,8 % случаев к «Секстафагу». Таким образом, в целом региональные штаммы клебсиелл характеризовались низким уровнем чувствительности к специфическим лечебным бактериофагам, что могло быть одной из основных причин низкой эффективности терапии используемыми в настоящее время коммерческими бактериофагами.

Был произведён скрининг изолятов Klebsiella spp. на наличие нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез факторов патогенности mag A, uge, kfu, bfp, stx 1, stx 2 [2; 5; 9; 10]. В аутоштаммах клебсиелл обеих групп частота встречаемости гена uge, кодирующего уридин-дифосфат-галактозо-4-эпимеразу и оказывающего существенное влияние на вирулентность, регистрировалась в 28,3 % и 22,5 % случаев соответственно. Также этот ген был обнаружен у стафилококка в ассоциации с Klebsiella spp. в 12,5 % случаев. Ген kfu, кодирующий систему поглощения железа, не был зарегистрирован у штаммов клебсиелл 1 группы, в то время как у аутоштаммов клебсиелл, вегетирующих совместно с золотистым стафилококком (группа 2) – выявлялся с одинаковой частотой как у клебсиелл, так и у золотистого стафилококка (2,5 % случаев соответственно). Ген bfp, кодирующий связывание пилей, был выявлен не только у клебсиелл обеих групп (6,7 и 2,5 % случаев соответственно), но и у S. aureus в 15 % случаев, что говорит о высоком адгезивном потенциале ассоциации клебсиелл и золотистого стафилококка. У детей второй группы в 15 % случаев был выявлен ген stx 1, что почти в три раза меньше чем у образцов клебсиелл в монокультуре (6,7 %). Ген stx 2 был обнаружен только в 3,3 % случаев у образцов клебсиелл в монокультуре (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика изолятов Klebsiella spp. по признаку детекции генов патогенности

Примечание. Количество изолятов / частота встречаемости, (%).

Ген mag A у клебсиелл был обнаружен только в сочетании с геном uge (2,5 %) второй группы детей, что свидетельствовало о редкой встречаемости штаммов способных продуцировать слизистую субстанцию повышенной вязкости. Сочетания генов uge+kfu регистрировались примерно на одном уровне в обеих группах (8,3 % и 12,5 % случаев соответственно). Сочетания генов uge+bfp были выявлены в образцах клебсиелл как в монокультуре (16,7 %), так и в образцах клебсиелл в ассоциации (10,0 %). Также данное сочетание генов патогенности было выявлено в 5,0 % случаев у золотистого стафилококка. Сочетание генов
uge+stx 1 были зарегистрированы только в образцах клебсиелл обеих групп почти с одинаковой частотой (11,7 и 12,5 %), также как и сочетание генов bfp+stx 1 (1,7 и 2,5 % случаев соответственно) (табл. 3).

Таблица 3

Парные сочетания генов патогенности, %

Примечание. Количество изолятов / частота встречаемости, ( %).

Сочетания трех и более генов патогенности встречались достаточно часто, и в основном, в образцах клебсиелл в монокультуре (табл. 4).

Таблица 4

Сочетания трех и более генов патогенности, %

Примечание. Kоличество изолятов / частота встречаемости, ( %).

Наиболее часто у клебсиелл, вегетирующих в составе исследуемых ассоциаций, регистрировалось сочетание генов uge+kfu+stx 1 (7,5 %). У образцов клебсиелл первой группы были выявлены сочетания четырех генов патогенности uge+kfu+bfp+stx 1 (1,7 %).

Заключение

У детей первого года жизни, в кишечном биотопе которых регистрировалась высокая популяционная плотность клебсиелл, вегетировали штаммы с наличием генов патогенности. Исследуемые аутоштаммы клебсиелл (n=100) были чувствительны практически ко всем тестируемым антибиотикам разных групп. Региональные штаммы клебсиелл характеризовались низким уровнем чувствительности к специфическим лечебным бактериофагам, что может быть одной из основных причин низкой эффективности терапии используемыми в настоящее время коммерческими бактериофагами.

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о том, что среди штаммов клебсиелл, не являющихся клиническими, а вегетирующих в кишечнике детей в качестве составляющей аллохтонной микробиоты, может быть сосредоточен достаточно заметный патогенный потенциал. Выявление генов патогенности у штаммов Klebsiella spp. в ассоциации со S. aureus различной степени вирулентности показало увеличение частоты встречаемости искомых ампликонов. Следовательно, в результате взаимоадаптации микросимбионтов происходило увеличение численности особей, в генотипе которых локализованы uge, kfu, mag A, bfp, stx 1, stx 2 гены и их сочетания, что явилось свидетельством их взаимного влияния на способность реализации патогенного потенциала в условиях ассоциативного симбиоза. А взаимовлияние ассоциативных симбионтов приводит к селекции и накоплению вирулентных вариантов в бактериальной популяции, которые могут быть этиологически ассоциированными с заболеваниями кишечного тракта.

Решение вопроса о роли клебсиелл с набором генов патогенности, а также их ассоциаций с золотистым стафилококком, с высокой частотой встречающихся в кишечнике детей первого года жизни, требует пристального внимания учёных и клиницистов и необходимости дальнейшего изучения.