Научный журнал
Успехи современного естествознания
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,775

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННОГО ВНУТРИВЕННОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

Долматов В.Ю. Дробкова А.В. Погорельский И.П. Мальцева О.В. Шевцов А.Н. Елагин Г.Д. Белова Е.В. Боровской Д.В. Карпова М.В. Вершинина О.А. Блинова Е.А. Лютов А.Г. Шарыгин С.Л.

Одной из научных проблем современной инфектологии является совершенствование медицинской помощи людям, заражённым сибирской язвой. С целью её решения начата фармацевтическая разработка патогенетического лекарственного препарата - противосибиреязвенного внутривенного иммуноглобулина человека (ВВИГ). Многолетний опыт создания и применения специфичных ВВИГ различной направленности, требования к эффективности и безопасности современных иммуноглобулинов, сведения о патогенезе сибирской язвы позволили сформулировать дизайн разработки: иммунологически активная белковая фракция, выделенная из плазмы крови доноров, содержащая терапевтически значимое количество антител к протективному антигену (ПА) сибиреязвенного микроба, безопасная в плане передачи гемотрансмиссивных инфекций и пригодная для внутривенного введения.

Кадровых доноров, давших письменное информированное согласие на участие в исследовании, по мере прохождения медицинского осмотра делили на две группы и иммунизировали однократно подкожно в объеме 0,5 мл «Вакциной сибиреязвенной комбинированной сухой и жидкой для подкожного применения» производства ФГУ «48 Центральный НИИ Министерства обороны РФ» (ЦНИИ МО). Донорам первой группы (38 человек) вводили вакцину серии 1/02 (сухая форма), донорам второй группы (23 человека) - вакцину серии 5/02 (жидкая форма). Уровень антител к ПА Bacillus anthracis в сыворотке крови иммунизированных людей определяли методом непрямого гетерогенного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением «Тест-системы иммуноферментной для определения титров антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба в сыворотке крови человека», разработанной сотрудниками ЦНИИ МО. После регистрации целевых антител в титре не менее 1:200 осуществляли заготовку плазмы методом плазмафереза; плазму немедленно замораживали и хранили при температуре не выше минус 20 °С.

Из 12 порций иммунной плазмы, выбранных случайным образом, этанольным методом в лабораторных условиях были получены 6 образцов раствора иммуноглобулинов, содержащего антитела к ПА B. anthracis. Изучение уровня целевых антител в технологических растворах на всех стадиях фракционирования, а также определение основных биохимических параметров конечного раствора иммуноглобулинов позволили сделать заключение о стабильности целевых антител в условиях технологического процесса и возможности их концентрации этанольным методом. На основании данных литературы и результатов определения превентивных свойств полученного раствора иммуноглобулинов в эксперименте на мышах установлено минимальное и достаточное содержание антител к ПА B. anthracis в разрабатываемом противосибиреязвенном ВВИГ и иммунной плазме. Готовый препарат должен содержать целевые антитела в титре не менее 1:1600, а исходная плазма - не менее 1:400 в ИФА.

Антитела к ПА B. anthracis в титре 1:400 или выше, то есть на значимом уровне, были выявлены у 70 % иммунизированных доноров. Средняя суммарная продолжительность регистрации целевых антител в титре не менее 1:400 составила 8 недель, при этом динамика их содержания по результатам 20-недельного мониторинга имела амплитудно-затухающий характер. Ввиду того, что уровень целевых антител периодически снижался до незначимых титров, с целью облегчения определения сроков, благоприятных для заготовки иммунной плазмы, был разработан алгоритмизированный график обследования доноров. График позволяет минимизировать количество предварительных исследований специфической активности крови доноров и заготовить максимально возможный объём иммунной плазмы. Следуя графику, можно дифференцировать доноров в зависимости от их иммунореактивности в отношении первичной иммунизации комбинированной сибиреязвенной вакциной на четыре категории. Относительное количество доноров каждой категории, а также средняя продолжительность регистрации целевых антител на значимом уровне в первой и второй группах доноров были попарно сопоставимы, что указывает на отсутствие существенных различий между применением для иммунизации сухой и жидкой форм вакцины.

Рациональность категорирования доноров была подтверждена результатами ревакцинации, проведённой не менее чем через 13 месяцев после первичной иммунизации. «Вакцину сибиреязвенную живую сухую для подкожного и скарификационного применения» серии 185 производства ЦНИИ МО вводили однократно подкожно в объёме 0,5 мл. На протяжении 36 недель (срок наблюдения) содержание антител к ПА B. anthracis в крови доноров с ранним ответом было равно или превышало аналогичной показатель в категории доноров с поздним ответом и ни разу не опустилось ниже значимого уровня. В то же время уровень целевых антител в крови доноров с поздним ответом периодически снижался до незначимых титров, а средняя суммарная продолжительность регистрации титров 1:400 или выше составила лишь 23 недели.

Изучение изменения специфической активности в процессе хранения образцов сыворотки, заготовленных при предварительных осмотрах иммунизированных доноров, позволило сделать заключение о стабильности антител к ПА B. anthracis в течение 12 месяцев при температуре не выше минус 30 °С.

Из 172 л иммунной плазмы методом этанольного фракционирования были получены 3 экспериментально-производственные серии препарата: серии №№ 1 и 2 - с применением пепсинолиза, серия № 3 - с применением инкубации раствора иммуноглобулинов в кислой среде. Параметры всех серий, в том числе показатели внутривенной толерантности и вирусбезопасности, соответствовали общепринятым нормам качества ВВИГ. По результатам ИФА серии №№ 1 и 2 содержали антитела к ПА B. anthracis в титре 1:1600, серия № 3 - в титре 1:3200. Уровень антител был стабилен в течение 31 месяца (срок наблюдения) при температуре от 2 до 6 °С. По результатам иммуноблоттинга и непрямого гетерогенного ИФА с использованием рекомбинантных антигенных детерминант сибиреязвенного микроба, полученных сотрудниками ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ГНЦ ПМБ), все серии содержали антитела к третьему и четвёртому доменам ПА, а также к летальному фактору (ЛФ) B. anthracis. Изучение изменения специфической активности в процессе лиофилизации экспериментальных образцов позволило сделать предварительное заключение о возможности получения сухой лекарственной формы препарата.

Противосибиреязвенная антитоксическая активность ВВИГ была оценена в МТТ-тесте на культуре клеток J774A.1, чувствительных к летальному токсину B. anthracis. Летальный токсин конструировали из полноразмерных рекомбинантных ПА и ЛФ, полученных сотрудниками ГНЦ ПМБ. Серии препарата №№ 1 и 2 нейтрализовали токсин в разведении 1:5, серия № 3 - в разведении 1:80.

Лечебную и профилактическую эффективность препарата изучали в экспериментах на животных (морских свинках и кроликах). Препаратом сравнения служил «Глобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий» серии 33 производства ЦНИИ МО. Морским свинкам вводили подкожно по 4 мл противосибиреязвенного ВВИГ или по 2 мл препарата сравнения. Через 24 ч животных заражали подкожным введением 50 LD50 штамма 71/12 B. anthracis в объёме 1 мл. На 10 сутки в опытной группе выжило 50 % животных, в группе сравнения - 67 %. Животные контрольной группы пали. Кроликов заражали подкожным введением 10 LD50 штамма Ч-7 B. anthracis в объёме 1 мл. Через 24 ч животным опытной группы вводили внутривенно по 2,4 мл исследуемого препарата, животным группы сравнения - по 1,2 мл препарата сравнения внутримышечно. Препараты в указанных дозах вводили ежедневно в течение 5 суток. На 15 сутки в опытной группе выжило 33 % животных, в группе сравнения - 50 %. Животные контрольной группы пали.

Эффективность противосибиреязвенного ВВИГ в комплексной терапии была изучена в опыте на кроликах. Животных заражали подкожным введением 50 LD50 штамма Ч-7 B. anthracis в объёме 1 мл. Через 24 ч животным опытной группы вводили внутривенно по 2,4 мл исследуемого препарата и по 560 мг ампициллина внутримышечно, животным первой группы сравнения - по 1,2 мл препарата сравнения и по 560 мг ампициллина внутримышечно, животным второй группы сравнения - по 560 мг ампициллина внутримышечно. Препараты в указанных дозах вводили 2 раза в сутки в течение 5 дней. На 30 сутки в опытной группе выжило 60 % животных, в первой группе сравнения - 60 %, во второй группе сравнения - 20 %. Животные контрольной группы пали.

Таким образом, в результате проведённых исследований получены экспериментальные образцы нового антитоксического лекарственного средства - противосибиреязвенного ВВИГ, обладающего лечебной и профилактической эффективностью; начато формирование регистрационного досье препарата.


Библиографическая ссылка

Долматов В.Ю., Дробкова А.В., Погорельский И.П., Мальцева О.В., Шевцов А.Н., Елагин Г.Д., Белова Е.В., Боровской Д.В., Карпова М.В., Вершинина О.А., Блинова Е.А., Лютов А.Г., Шарыгин С.Л. ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННОГО ВНУТРИВЕННОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА // Успехи современного естествознания. – 2008. – № 5. – С. 96-97;
URL: https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=10018 (дата обращения: 19.03.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674