Научный журнал
Успехи современного естествознания
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,736

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРНЫХ СВОЙСТВ КАРБОГИДРАЗ

Ковалева Т.А. Холявка М.Г. Битюцкая Л.А. Гречкина М.В.

Для исследования особенностей надмолекулярной организации ферментов в настоящее время успешно применяются различные сочетания классических методов биохимического анализа и современные биофизические подходы, в том числе метод атомно-силовой микроскопии (АСМ). Объектом исследований является инулиназа из Kluyveromyces marxianus Y-303, которая гидролизует инулин и другие фруктозосодержащие полимеры. Данный фермент может использоваться для получения фруктозы из инулинсодержащего растительного сырья, а изготовленные из инулина фруктозные сиропы применяются в кондитерской промышленности, в лечебном питании, а также для профилактики сахарного диабета, кариеса и ожирения.

Гомогенность фракций фермента и его субъединиц контролировали электрофоретическим анализом. Содержание белка определяли методом Лоури, каталитическую активность энзима измеряли спектрофотометрически. Визуализацию олигомерной структуры инулиназы осуществляли с помощью атомно-силовой микроскопии на сканирующем зондовом микроскопе SOLVER P47PRO фирмы НТ-МДТ. Для изучения четвертичной структуры фракции фермента инкубировали с додецилсульфатом натрия (ДСН) в концентрации 3,5·10-5 моль/л. При гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-150 субъединицы выходят двумя пиками, что свидетельствует об асимметричности их строения. Кажущаяся молекулярная масса субъединиц равна 54,8 кДа и 8,4 кДа. Установлено, что они обладают каталитической активностью 1,35±0,21 ед/мг и 1,05±0,23 ед/мг соответственно.

Нами были получены изображения молекул инулиназы на пластинках свежесколотой слюды. Показано, что данный белок имеет олигомерную структуру и состоит из двух субъединиц, различных по размеру. Длина глобулы намного превышает ее высоту, возможно, что такое уплощение молекулы происходит за счет многоточечного связывания заряженных аминокислотных остатков, расположенных на поверхности белка, с поверхностью слюды. Показано, что высота большей субъединицы (54,8 кДа) превышает высоту малой (8,4 кДа) в 2 раза. При разделении белка на субъединицы происходит изменение их структуры, а следовательно, и размеров по отношению к нативному препарату. При разделении димера инулиназы на мономеры происходит небольшая их компактизация, и субъединицы практически сравниваются по высоте.

Таким образом, результаты экспериментов по гель-хроматографии, электрофорезу и визуализации олигомерной структуры методом атомно-силовой микроскопии, позволяют сделать заключение о том, что четвертичная структура инулиназы Kluyveromyces marxianus представлена двумя субъединицами, различающимися по размерам, молекулярной массе и активности. Процессы диссоциации-ассоциации субъединиц, возможно, принимают участие в процессе регуляции каталитической активности данного фермента.


Библиографическая ссылка

Ковалева Т.А., Холявка М.Г., Битюцкая Л.А., Гречкина М.В. АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРНЫХ СВОЙСТВ КАРБОГИДРАЗ // Успехи современного естествознания. – 2008. – № 6. – С. 79-79;
URL: http://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=10116 (дата обращения: 21.11.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074