Научный журнал
Успехи современного естествознания
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,560

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЧАСТОТ ГЕНОТИПОВ ГЕНА DRB1 HLA II КЛАССА И ИХ СОЧЕТАНИЙ С ГЕНОТИПАМИ CT/TT ПОЛИМОРФИЗМА rs 2476601 ГЕНА PTPN22 У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА И САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА В СОЧЕТАНИИ С АУТОИММУННЫМИ ТИРЕОПАТИЯМИ

Репина Е.А. 1 Болдырева М.Н. 2 Сунцов Ю.И. 1 Батенева Е.И. 3 Кадочникова В.В. 2 Ильин А.В. 1 Трошина Е.А. 1
1 ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ
2 ФГБУ «ГНЦ институт иммунологии» ФМБА РФ
3 ЗАО «ДНК-Технология»
Проведен сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов гена DRB1 HLA II класса и их сочетаний с генотипами CT/TT полиморфизма rs 2476601 гена PTPN22 у 134 пациентов с сахарным диабетом 1 типа (СД1) и 110 пациентов с сочетанием СД1 с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы (АИЗ ЩЖ) (88 пациентов с сочетанием СД1 с аутоиммунным тиреоидитом (АИТ) и 22 пациента с сочетанием СД1 с диффузным токсическим зобом (ДТЗ)). Контрольную группу составили 108 доноров крови без аутоиммунных заболеваний и отягощенной наследственности по ним. Установлены достоверные отличия между группами СД1 и контроля по частоте встречаемости генотипов высокого риска (ГВР) (p < 0,0001), а также по частоте встречаемости ГВР между группами СД1+АИЗ ЩЖ и контроля (p < 0,0001). Согласно полученным данным, дополнительно к основным ГВР для СД1 можно отнести генотип 4/13 (p = 0,0088, OR = 5,984 (1,329–26,94)). Группы СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ не отличаются по частоте встречаемости ГВР гена DRB1 HLA II класса.
сахарный диабет 1 типа
аутоиммунные тиреопатии
ген DRB1 HLA II класса
ген PTPN22
аллельные варианты
полиморфизм
1. Абатуров А.Е., Петренко Л.Л., Герасименко О.Н., Агафонова Е.А., Высочина И.Л., Кривуша Е.Л., Ермолаева  О.А. Хронический аутоиммунный тиреоидит у детей // Здоровье ребенка. – 2009. – № 1(16). – С. 18–23.
2. Алексеев Л.П., Дедов И.И., Хаитов Р.М., Болдырева М.Н., Шестакова М.В., Петеркова В.А., Кураева Т.Л., Прокофьев С.А. Клиническая значимость определения HLA-DRB1-генотипов, ассоциированных с предрасположенностью или устойчивостью к сахарному диабету 1 типа в различных этнических группах России. // Сахарный диабет. – 2007. – № 3. – С. 2–5.
3. Болдырева М.Н., Хаитов Р.М., Дедов И.И., Богатова О.В., Гуськова И.А., Янкевич Т.Э. и др. Новый взгляд на механизм HLA ассоциированной предрасположенности к сахарному диабету 1 типа. Теоретические и прикладные аспекты. // Иммунология. – 2005. – № 26(6). – С. 324–329.
4. Репина Е.А. Общие генетические маркеры сахарного диабета 1 типа и аутоиммунных заболеваний щитовидной железы // Сахарный диабет. – 2011. – № 2. – С. 23–31.
5. Репина Е.А., Атаманова Т.М., Зверева Я.С., Тишина  Ю.В., Прокофьев С.А. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов HLA II класса у пациентов с сахарным диабетом 1 типа в отсутствие и в сочетании с аутоиммунным тиреоидитом // Сахарный диабет. – 2013. – № 4. – С. 23–27.
6. Репина Е.А., Болдырева М.Н., Сунцов Ю.И., Батенева Е.И., Кадочникова В.В., Ильин А.В., Трошина Е.А. Особенности распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма rs 2476601 гена PTPN22 у пациентов с сахарным диабетом 1 типа и сахарным диабетом 1 типа в сочетании с аутоиммунными тиреопатиями // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 4. – C. 81–84.
7. Bottini N., Musumeci L., Alonso A., Rahmouni S., Nika  K., Rostamkhani M., MacMurray J., Meloni G.F., Lucarelli  P., Pellecchia M., Eisenbarth G.S., Comings  D., Mustelin T. A functional variant of lymphoid tyrosine phosphatase is associated with type I diabetes. // Nat. Genet. – 2004. – № 36. – P. 337–338.
8. Fousteri G., Jofra T., Di Fonte R., Kuka M., Iannacone  M., Battaglia M. PTPN22 controls virally-induced autoimmune diabetes by modulating cytotoxic T lymphocyte responses in an epitope-specific manner. // Immunol.Res. – 2014. – № 60. – P. 193–200.
9. Fousteri G., Liossis S.N., Battaglia M. Roles of the protein tyrosine phosphatase PTPN22 in immunity and autoimmunity. // Clin. Immunol. – 2013. – № 149. – P. 556–65.
10. Huber A., Menconi F., Corathers S., Jacobson E.M., Tomer Y. Joint genetic susceptibility to type 1 diabetes and autoimmune thyroiditis: from epidemiology to mechanisms. // Endocr. Rev. – 2008. – № 29. – P. 697–725.
11. Salmond R.J., Brownlie R.J., Morrison V.L., Zamovska R. The tyrosine phosphatase PTPN22 discriminates weak self peptides from strong agonist TCR signals. // Nat. Immunol. – 2014. – № 15. – P. 875–83.
12. Wiersinga W.M. Thyroid autoimmunity. // Endocr. Rev. – 2014. – № 26. – P. 139–57.

Сахарный диабет 1 типа (СД1) – полигенное многофакторное заболевание, развитие которого связано с аутоиммунной деструкцией β-клеток поджелудочной железы.

Генетическая предрасположенность играет определяющую роль в механизмах манифестации и прогрессирования аутоиммунного воспаления при СД1 [2, 4].

К настоящему времени известно 50 генов, находящихся на разных хромосомах, которые в той или иной степени предрасполагают к СД1. Из них 16 ассоциированы с развитием не только СД1, но и других аутоиммунных заболеваний (АИЗ), таких как: АИЗ щитовидной железы (АИЗ ЩЖ), болезнь Аддисона, целиакия, системная красная волчанка, ревматоидный артрит [10].

Наибольший вклад в предрасположенность к СД1 и другим АИЗ принадлежит локусу IDDM1, на котором находятся гены главного комплекса гистосовместимости HLA II класса [2]. Расположенный на коротком плече 6 хромосомы (6p21), локус HLA II класса у людей, по оценкам ученых, вносит примерно 40–50 % от общего вклада в наследственный риск развития СД1.

Еще одним геном, который также вносит существенный вклад в предрасполо-женность к СД1 и другим АИЗ, является ген PTPN22. Он находится на первой хромосоме (1p13.3-p13.1). Его белковый продукт принадлежит к семейству белков тирозиновой фосфатазы (ЛФТ), которая является мощным ингибитором антигена Т-клеточного рецептора сигнального пути. Замена аргининового на триптофановый аминокислотный остаток (кодон 620 – R620W) исключает возможность взаимодействия PTPN22 с CSK, что приводит к нарушению обратной регуляции активированных лимфоцитов [1, 7–9].

Из всех вариантов сочетаний АИЗ наиболее часто встречается сочетание СД1 и АИЗ ЩЖ. До 50 % больных СД1 имеют положительные титры антител к ткани щитовидной железы, из них примерно у 50 % отмечаются клинические проявления АИЗ ЩЖ [9, 11, 12]. Такое глубокое взаимопроникновение одной патологии в другую, с одной стороны, существенно затрудняет изучение патогенетических механизмов развития каждого из компонентов синдрома, а с другой стороны делает эту модель поистине уникальной в плане перспектив изучения общих иммунопатологических механизмов.

Задачей настоящего исследования является сравнительный анализ распределения частот генотипов гена DRB1 HLA II класса и их сочетаний с генотипами CT/TT полиморфизма rs 2476601 гена PTPN22 у пациентов с СД1 и пациентов, имеющих сочетание СД1 с АИЗ ЩЖ.

Материалы и методы исследования

В исследование было включено 249 пациентов с СД1, которые находились на обследовании и лечении в ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ. Все пациенты были разделены на 3 группы: в первую группу вошло 89 пациентов с СД1 и аутоиммунным тиреоидитом (АИТ) (средний возраст пациентов 33,0 ± 14,0 лет, из них мужчин – 13 (0,146), женщин – 76 (0,854)), вторую группу составили 22 пациента с СД1 и диффузным токсическим зобом (ДТЗ) (средний возраст пациентов 33,1 ± 16,4 лет, из них мужчин – 7 (0,318), женщин – 15 (0,682)), в третью группу вошло 138 пациентов с СД1 и отрицательными титрами антител к ткани щитовидной железы (АтЩЖ) (средний возраст пациентов 24,2 ± 12,9 лет, из них мужчин – 68 (0,491), женщин – 15 (0,682)). Контрольную группу составили 108 человек из Московской популяции без аутоиммунных заболеваний и отягощенной наследственности по ним, средний возраст в контрольной группе (n = 108) – 46,3 ± 9,3 лет, мужчин 73 (68 %), женщин – 35 (32 %). У всех пациентов предварительно было получено информированное согласие на проведение данного исследования.

HLA-генотипирование по аллельным вариантам гена DRB1 HLA II класса выполнялось методом сиквенс-специфических праймеров с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для определения полиморфных аллелей данного гена применялись коммерческие наборы производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (Россия). Амплификацию производили на амплификаторах «Терцик» (Россия).

Типирование однонуклеотидного полиморфизма rs 2476601 гена PTPN22 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флюоресцентными метками и автоматической регистрацией результатов реакции в режиме реального времени (real-time PCR) наборами компании «ДНК-Технология» (Москва) на приборе ДТ-96 («ДНК-Технология») в соответствии с инструкциями производителя.

Количественное определение титров аутоантител к тиреоглобулину (ATG) и тиреопероксидазе (ATPO) в сыворотках крови осуществляли методом непрямого иммуно-ферментного анализа с использованием наборов фирмы «Biomerica» (лаборатория клинической биохимии ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ, зав. – А.В. Ильин).

Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных подходов, используемых при проведении популяционно-генетических исследований.

Аллельные варианты полиморфного гена подвергались классическому молекулярно-эпидемиологическому анализу – сопоставлению встречаемости аллелей и генотипов у больных СД1, СД1+АИТ и контролей.

Ассоциацию между заболеванием и генотипом определяли с помощью критерия χ2 (c коррекцией Йейтса на непрерывность выборки), либо точным двусторонним критерием Фишера, сравнивая распределение генотипов и аллелей по каждому полиморфизму между группами пациентов и контролей. Статистика: аллель предрасположенности (риска) А против второго аллеля (протекторного) В.

Показатели «отношения шансов» (OR-odds ratio) с 95 % доверительным интервалом (95 % CI) рассчитывались для «редкого» аллеля, носителей «редкого» аллеля (гетерозигот + гомозигот по «редкому» аллелю) относительно «частых» аллелей и гомозигот по «частому» аллелю соответственно. Аналогичный расчет проводился для гомозигот по «редкому» аллелю относительно гетерозигот и гомозигот по «частому» аллелю.

Сравнение частот встречаемости сочетаний генотипов проводилось с использованием точного двустороннего критерия Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение

Нами был проведен сравнительный анализ распределения частот генотипов гена DRB1 HLA II класса у пациентов с СД1 и СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ с учетом известных предрасполагающих/защитных вариантов гена DRB1 HLA II класса [5]. Все типированные образцы от больных СД1 в зависимости от HLA-генотипа были разделены на три группы: группа высокого риска (ГВР), если в генотипе присутствовали любые два варианта гена DRB1 из группы DRB1: *01, *03, *04, *08, *09, *10; группа низкого риска (ГНР) – в генотипе присутствовали любые два варианта гена DRB1: *07, *11, *12, *13, *14, *15, *16; группа промежуточного риска (ГПР), если в генотипе один вариант был из группы DRB1: *01, *03, *04, *08, *09, *10, а другой – из группы DRB1: *07, *11, *12, *13, *14, *15, *16 [3].

Исследование частоты встречаемости вариантов генотипов гена DRB1 HLA II класса.

Нами не было получено значимых отличий по исследуемым генам между группами СД1+АИТ и СД1+ДТЗ, поэтому при дальнейшем анализе эти группы были объединены в одну общую – СД1+АИЗ ЩЖ.

Анализ распределения частот генотипов гена DRB1 HLA II класса выявил отсутствие различий по распределению ГВР, ГПР и ГНР в группах СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ (p = 0,5819) и достоверное различие в распределении частоты встречаемости этих групп генотипов у пациентов с СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ по сравнению с группой контроля (p < 0,0001). В частности, было показано повышение встречаемости ГВР в группах больных СД1, серонегативных по АтЩЖ, – 86/0,623 (p < 0,0001), OR = 12,09 (6,158–23,72) и пациентов с сочетанием СД1 и АИЗ ЩЖ – 68/0,613 (p < 0,0001), OR = 11,56 (5,772–23,14) по сравнению со здоровыми лицами 13/0,12 (табл. 1).

Помимо основных групп генотипов гена DRB1 HLA II класса (высокого и низкого риска для развития СД1) было выделено 6 генотипов: 1/4, 4/4, 4/7, 4/13, 4/17, 17/17, показавших наибольшую частоту встречаемости в исследуемых группах пациентов. Для четырех из них было получено достоверное отличие частоты в группах СД1 и контроля: 1/4 – p < 0,0001, OR = 33,32 (1,982–559,9); 4/13 – p = 0,0088, OR = 5,984 (1,329–26,94); 4/17 – p < 0,0001, OR = 61,00 (3,681–1011); 17/17 – p = 0,0054, OR = 15,92 (0,9154–276,8), для двух – в группах СД1 + АИЗ ЩЖ и контроля: 1/4 – p = 0,0016, OR = 22,45 (1.298–388.3); 4/17 – p < 0,0001, OR = 59,00 (3,557–978,5). При этом генотип 13/17, относящийся к группе генотипов промежуточного риска, показал в настоящем исследовании достоверно большую встречаемость при СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ по сравнению с контрольной группой. Также обращала внимание некоторая неоднородность изолированного СД1 и СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ по спектру генотипов риска – 4 для СД1 и только 2 для СД1+АИЗ ЩЖ. При этом непосредственно между группами достоверных отличий получено не было. Интересно, что генотип 4/4, традиционно относимый к генотипам высокого риска, в нашей выборке не показал достоверного отличия частоты встречаемости между группами СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ и по сравнению с группой контроля (табл. 2).

В предыдущей работе нами получена достоверная ассоциация полиморфизма rs 2476601 гена PTPN22 с повышенным риском развития сочетания СД1 и АИЗ ЩЖ. При этом было установлено, что аллель Т и генотип ТТ являются аллелем и генотипом высокого риска для развития аутоиммунного полигландулярного синдрома 2 типа [6]. В связи с этим нами было проанализировано распределение частоты встречаемости сочетания ГВР гена DRB1 HLA II класса с генотипами СТ и ТТ гена PTPN22 как носителями аллеля высокого риска между группами СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ. Также было проанализировано распределение частоты встречаемости сочетания ГПР гена DRB1 HLA II класса с генотипами СТ и ТТ гена PTPN22 как носителями аллеля высокого риска между группами СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ. Было показано, что группы СД1+АИЗ ЩЖ и СД1 не отличаются по частоте встречаемости ГПР в сочетании с генотипами CT/TT гена PTPN22 – 22/110 (0,2) и 15/134 (0,11) соответственно (p = 0,0724). Изолированно генотип TT гена PTPN22 в сочетании с ГВР гена DRB1 HLA II класса встречается крайне редко и достоверных отличий между исследуемыми группами не показал.

Нами также было проанализировано распределение частоты встречаемости сочетания генотипов гена DRB1 HLA II класса, определенных в настоящем исследовании как генотипы риска (1/4, 4/13, 4/17, 17/17), с генотипами СТ и ТТ гена PTPN22 (носителями аллеля высокого риска) между группами СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ (табл. 3).

Было показано, что группы СД1+АИЗ ЩЖ и изолированный СД1 не отличаются по частоте встречаемости генотипов 1/4, 4/13, 4/17, 17/17 в сочетании с генотипами CT/TT гена PTPN22, что, с нашей точки зрения, можно объяснить общностью генотипов гена DRB1 HLA II класса для исследуемых групп.

Таблица 1

Сравнительный анализ распределения частот генотипов гена DRB1 HLA II класса высокого, низкого и промежуточного риска по развитию аутоиммунных заболеваний в исследуемых группах и контроле

Группы

Частота генотипов, абс./отн.

ГВР

ГПР

ГНР

Всего:

СД1 + АИТ (89)

64/0,719

23/0,258

2/0,023

89/1

СД1 + ДТЗ (22)

4/0,182

17/0,773

1/0,045

22/1

СД1 + АИЗ ЩЖ (111)

68/0,613

40/0,36

3/0,027

111/1

СД1 (138)

86/0,623

45/0,326

7/0,051

138/1

Контроль (108)

13/0,12

45/0,417

50/0,463

108/1

Таблица 2

Сравнительный анализ распределения частот основных генотипов высокого риска (ГВР) гена DRB1 HLA II класса, продемонстрировавших наибольшую встречаемость в анализируемой выборке

Генотип DRB1

1/4

4/4

4/7

4/13

4/17

17/17

(1) СД1 (138) – 66,1 %

18/0,13

10/0,073

10/0,073

14/0,1

30/0,22

9/0,065

(2) СД1 + АИЗ ЩЖ (111) – 64,7 %

10/0,09

10/0,09

8/0,072

8/0,072

29/0,26

7/0,063

(3) Контроль (108) – 5,2 %

0/0

2/0,012

3/0,028

2/0,012

0/0

0/0

p(СД1-контроль)

p(СД1+АИЗ ЩЖ-контроль)

p(СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ)

< 0,0001

0,0016

0,42

0,0721

0,0337

0,6449

0,1552

0,2151

1,0000

0,0088

0,1016

0,5035

< 0,0001

< 0,0001

0,4552

0,0054

0,0142

1,0000

Таблица 3

Распределение частот генотипов гена DRB1, часто встречающихся при СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ в сочетании с генотипами носителей аллеля риска (T) гена PTPN22

Сочетание генотипов DRB1 и PTPN22

1/4-CT/TT

4/13-CT/TT

4/17-CT/TT

17/17-CT/TT

СД1 (134)

3/0,022

1/0,0075

11/0,082

5/0,037

СД1 + АИЗ ЩЖ (110)

7/0,064

2/0,018

12/0,109

3/0,0273

Контроль (108)

0/0

0/0

0/0

0/0

p(СД1 и СД1 + АИЗ ЩЖ)

0,1191

0,5901

0,5142

0,7328

Выводы

Таким образом, группы СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ не отличаются по частоте встречаемости генотипов, относящихся к различным группам риска гена DRB1 HLA II класса.

Группы СД1+АИЗ ЩЖ и контроля достоверно отличаются по частоте встречаемости ГВР (p < 0,0001, OR = 11,56 (5,772–23,14)).

Группы СД1 и контроля достоверно отличаются по частоте встречаемости ГВР (p < 0,0001, OR = 12,09 (6,158–23,72)).

Дополнительно к основным генотипам высокого риска для СД1 можно отнести генотип 4/13 (p = 0,0088, OR = 5,984 (1,329–26,94)).

Источник финансирования – работа выполнена на средства, выделенные для Федеральной целевой программы «Сахарный диабет».


Библиографическая ссылка

Репина Е.А., Болдырева М.Н., Сунцов Ю.И., Батенева Е.И., Кадочникова В.В., Ильин А.В., Трошина Е.А. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЧАСТОТ ГЕНОТИПОВ ГЕНА DRB1 HLA II КЛАССА И ИХ СОЧЕТАНИЙ С ГЕНОТИПАМИ CT/TT ПОЛИМОРФИЗМА rs 2476601 ГЕНА PTPN22 У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА И САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА В СОЧЕТАНИИ С АУТОИММУННЫМИ ТИРЕОПАТИЯМИ // Успехи современного естествознания. – 2015. – № 4. – С. 63-67;
URL: http://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=35066 (дата обращения: 19.08.2018).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252