Научный журнал
Успехи современного естествознания
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,823

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИДОКАИНА И БУПИВАКАИНА В ТКАНИ ПЕЧЕНИ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Смирнова А.В. 1 Фомин А.Н. 1 Семёнов М.Б. 2 Каджоян Л.В. 1
1 ФГБОУ ВО «Ярославский государственный медицинский университет» Минздрава России
2 ООО «Такеда Фармасьютикалс»
Разработана методика количественного определения лидокаина и бупивакаина методом капиллярного электрофореза («Капель-105», ООО «Люмекс-Центрум», г. Санкт-Петербург). Предложенная методика линейна (коэффициенты корреляции составили 0,9991 и 0,9997 для лидокаина и бупивакаина соответственно), а также характеризуется удовлетворительной повторяемостью и воспроизводимостью (коэффициент вариации не превышает 1 %, а относительная ошибка среднего результата – 1,08 %). Изучены условия экстракции исследуемых анестетиков из водных растворов с учетом влияния природы экстрагента, рН среды, кратности и объема экстрагирования. Установлено, что наибольший процент экстракции наблюдается с использованием в качестве экстрагента хлороформа при рН 10,0 (бупивакаин), рН 9,0 (лидокаин), при соотношении водной и органической фаз 1:1, кратности экстрагирования равной трем и составляет 94,71 % и 80,43 % для бупивакаина и лидокаина соответственно. Дана сравнительная оценка методов выделения исследуемых веществ из ткани печени с использованием извлекателей: раствора щавелевой кислоты, рН 2,0, раствора уксусной кислоты, рН 2,0 и раствора трихлоруксуной кислоты (ТХУК), рН 1,0. Наибольшая степень выделения наблюдается с извлекателем – раствором щавелевой кислоты, рН 2,0 и составила 69,20 % и 64,82 % для лидокаина и бупивакаина соответственно. При этом граница определения составила 0,5 мкг, а граница обнаружения 0,1 мкг исследуемых веществ в 1,0 г ткани печени. Разработанные методики количественного определения лидокаина и бупивакаина в ткани печени являются валидными по критерию повторяемости результатов измерений в пределах рекомендуемых аналитических областей, а также обладают высокой чувствительностью, селективностью и экспрессностью и могут быть рекомендованы для проведения судебно-химического (химико-токсикологического) и клинического лабораторного анализов.
лидокаин
бупивакаин
ткань печени
капиллярный электрофорез
1. Калви Т.Н. Фармакология для анестезиолога / Т.Н. Калви, Н.Е. Уильямс: пер. с англ. – М.: БИНОМ, 2007. – 176 с.
2. Местная анестезия. Практическое руководство / М. Малрой, К.М. Бернардс, С.Б. Макдональд, Ф.В. Салинас. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2014. – 400 с.
3. Рафмелл Д.П. Регионарная анестезия: Самое необходимое в анестезиологии / Д.П. Рафмелл, Д.М. Нил, К.М. Вискоуми; пер. с англ.; под общ. ред. А.П. Зильбера, В.В. Мальцева. – 3-е изд. – М.: МЕДпресс-информ, 2013. – 272 с.
4. Джурко Ю.А. Исследование артикаина в биологических объектах методом капиллярного электрофореза: автореф. дис. … канд фарм. наук. – Москва, 2006. – 26 с.
5. Комарова Н.В. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ»/ Н.В. Комарова, Я.С. Каменцев. – СПб.: ООО «Веда», 2006. – 212 с.
6. Идентификация артикаина и бупивакаина методом капиллярного электрофореза / А.Н. Фомин [и др.] // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2010. – № 7. – С. 68–72.
7. Идентификация ряда азотсодержащих соединений основного характера в присутствии соэкстрактивных веществ мочи и крови методом капиллярного электрофореза / А.Н. Фомин [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. – 2010. – Т. 44, № 9. – С. 46–48.

В последние годы в медицинской практике использование местных анестетиков стало довольно распространенным явлением. В первую очередь это связано с появлением местноанестезирующих лекарственных средств амидного типа (лидокаин, мепивакаин, бупивакаин, ропивакаин и др.), которые открыли новые возможности для повышения эффективности и безопасности контроля над болью. Кроме этого, развитие некоторых видов местной анестезии, таких как спинномозговая, эпидуральная и др., привело к увеличению числа хирургических операций на амбулаторных больных, а также к появлению новых, вызывающих меньшее кровотечение хирургических техник [1–3].

В то же время местные анестетики по частоте развития лекарственных осложнений стабильно занимают одно из первых мест. Побочные эффекты токсического характера развиваются, как правило, на фоне повышенных концентраций препарата в крови при использовании их в дозах, превышающих рекомендуемые, при случайном попадании в сосудистое русло или быстром введении препарата, а также индивидуальной непереносимости [1, 3].

При отравлении местноанестезирующими средствами паталогоанатомическая картина не характерна. Для выявления причины смерти лиц, принимавших анестетики, решающее значение приобретают результаты химико-токсикологического (судебно-химического) исследования. В то же время в клинической хирургической практике в ряде случаев возникает потребность проведения лабораторного анализа препарата в биологических средах [4]. В связи с этим актуальной задачей является разработка экспрессных, высокочувствительных и селективных методик анализа исследуемых соединений в биологических объектах.

Несмотря на значительное число работ, посвященных анализу местных анестетиков, продолжают оставаться актуальными вопросы исследования в области разработки новых и совершенствования существующих методик их химико-токсикологического анализа. Одним из современных и перспективных аналитических методов, отвечающих требованиям судебно-химической (химико-токсикологической) практики и клинической лабораторной диагностики, является капиллярный электрофорез (КЭ), характеризующийся сочетанием разделения веществ с последующей их детекцией в УФ-области спектра непосредственно в кварцевом капилляре. Метод отличается простым аппаратурным оформлением и доступными расходными материалами [4–6].

В связи с вышеизложенным целью исследования явилось изучение возможности количественного определения лидокаина и бупивакаина в ткани печени методом капиллярного электрофореза.

Исследования проводили с использованием системы капиллярного электрофореза «Капель-105» (ООО «Люмекс-Центрум», г. Санкт-Петербург). Ранее нами были установлены электрофоретические условия анализа исследуемых местных анестетиков (МА): рабочий электролит (РЭ) – буферный раствор Бриттона – Робинсона, рН 2,3; растворитель пробы (РП) – РЭ, разбавленный в 10 раз водой очищенной; ввод пробы – гидродинамическим способом (30 мбар х 15 сек); напряжение – +20 кВ; детектирование – при длине волны 200 нм; запись и обработка электрофореграмм (ЭФГ) – с помощью программного обеспечения «МультиХром для Windows» [4, 6, 7].

При разработке методики количественного определения МА методом КЭ готовили серию стандартных растворов МА в РП, содержащих от 0,5 до 20 мкг исследуемого вещества в 1 мл пробы и проводили электрофорез на приборе «Капель-105». Фотометрические сигналы (площади пиков) использовали для построения калибровочных графиков. При этом наблюдалась линейная зависимость величины фотометрического сигнала от концентрации МА в пробе. На основе полученных данных рассчитывали уравнения калибровочных графиков – y = 1,454x + 0,39 (r2 = 0,9991) для лидокаина и у = 1,085 х – 0,055 (r2 = 0,9997) для бупивакаина. Коэффициенты корреляции близки к единице, что подтверждает линейность методик в указанном диапазоне концентраций.

Для валидационной оценки методики количественного определения МА методом КЭ по уравнению калибровочного графика проводили электрофорез анестетиков с концентрацией 20, 10 и 1,0 мкг/мл в приведенных выше условиях. На ЭФГ определяли площади пиков и по уравнению калибровочного графика рассчитывали концентрации МА. При статистической обработке данных, полученных при количественном определении МА на трех уровнях концентраций (табл. 1, 2), отражается вполне удовлетворительная повторяемость и воспроизводимость результатов в пределах рекомендуемой аналитической области. Коэффициент вариации не превышает 1 %, а относительная ошибка среднего результата – 1,08 %.

Таблица 1

Воспроизводимость результатов методики количественного определения бупивакаина методом КЭ

Концентрация

бупивакаина, мкг/мл

Метрологические характеристики (n = 5)

smir01.wmf

S

СV %

S smir01.wmf

Δsmir01.wmf

smir04.wmf %

1,0

98,20

0,84

0,86

0,38

1,06

1,08

10,0

98,80

0,67

0,68

0,30

0,83

0,84

20,0

99,00

0,56

0,57

0,25

0,70

0,71

 

Таблица 2

Воспроизводимость результатов методики количественного определения лидокаина методом КЭ

Концентрация

лидокаина, мкг/мл

Метрологические характеристики (n = 5)

smir01.wmf

S

СV %

S smir01.wmf

Δsmir01.wmf

smir04.wmf %

1,0

99,84

0,74

0,74

0,33

0,92

0,92

10,0

100,04

0,54

0,54

0,24

0,67

0,67

20,0

100,14

0,64

0,64

0,29

0,80

0,80

 

Таблица 3

Сравнительная характеристика методов выделения МА из ткани печени

Экстрагент

Внесено МА

в 1,0 г печени, мкг

Определено МА (smir01.wmf, %; n = 5)

Лидокаин

Бупивакаин

%

%

Раствор щавелевой кислоты, рН 2,0

100,0

69,20

64,82

Раствор уксусной кислоты, рН 2,0

100,0

58,48

51,59

Раствор трихлоруксусной кислоты, рН 1,0

100,0

44,17

40,99

Контрольный опыт

Выделение и определение лекарственных средств в биологических объектах является одной из самых сложных задач судебно-химического (химико-токсикологического) и клинического лабораторного анализов. Трудность обусловлена изолированием микрограммовых количеств исследуемых соединений из биосубстратов и их очисткой от соэкстрактивных веществ [4, 7].

Предварительно нами были изучены условия экстракции анестетиков из водных растворов в зависимости от рН среды, природы органического растворителя, объема экстрагента и кратности экстрагирования. По результатам исследования установлено, что наибольший процент экстракции наблюдается с использованием в качестве экстрагента хлороформа при рН 10,0 (бупивакаин) и рН 9,0 (лидокаин), соотношении водной и органической фаз 1:1, кратности экстрагирования равной трем и составляет 94,71 % и 80,43 % для бупивакаина и лидокаина соответственно.

Также было проведено сравнительное изучение методов выделения искомых соединений с использованием извлекателей: раствора щавелевой кислоты, рН 2,0, раствора уксусной кислоты, рН 2,0 и раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК), рН 1,0. Исследование проводили по следующим методике: к 1 г мелкоизмельченной ткани печени добавляли 1 мл 0,01 % стандартных растворов МА, содержащих 100 мкг вещества в пробе, и перемешивали. Через 1 час к смеси добавляли 7 мл одного из вышеперечисленных извлекателей, перемешивали и оставляли на 1 час при периодическом перемешивании. Вытяжку центрифугировали (6000 об/мин, 10 мин). Надосадочную жидкость отделяли, добавляли 25 % раствор аммония гидроксида до рН 10,0 (бупивакаин) или рН 9,0 (лидокаин) по универсальной индикаторной бумаге и проводили жидкостное экстрагирование хлороформом (10 мл х 3, 10 мин). Хлороформные экстракты отделяли и оставляли в сухом защищенном от света месте для испарения. Сухие остатки при исследовании бупивакаина растворяли в 1,0 мл РП, при исследовании лидокаина – в 1 мл хлороформа и проводили реэкстрагирование 1 мл РП. Полученные реэкстракты центрифугировали (10000 об/мин, 10 мин) и количественно определяли методом КЭ в приведенных выше условиях.

Результаты исследований (табл. 3) показали, что наибольшая степень извлечения из ткани трупной печени наблюдается при использовании в качестве экстрагента раствора щавелевой кислоты, рН 2,0 и составляет 64,82 % для бупивакаина и 69,20 % для лидокаина.

При этом выбранные условия пробоподготовки позволяют эффектно провести очистку исследуемых оснований от соэкстрактивных веществ ткани печени (рисунок).

Для определения чувствительности методик количественного определения МА в биосубстрате к 1 г мелкоизмельченной ткани печени добавляли аликвоты стандартных растворов МА, содержащих определенное количество вещества в пробе. Дальнейшее выделение и определение осуществляли согласно разработанной методике. Результаты исследований представлены в табл. 4.

smir1.tif

ЭФГ бупивакаина (1) и лидокаина (2), выделенных из ткани печени; контрольный опыт (3). Экстрагент – раствор щавелевой кислоты, рН 2,0 («Капель – 105»)

Таблица 4

Количественное определение МА в тканях трупной печени

п/п

Внесено МА

в 1 г ткани печени, мкг

Определено МА

Бупивакаин

Лидокаин

мкг

%

Метрологические

характеристики

мкг

%

Метрологические

характеристики

1

20,0

13,21

66,04

smir01.wmf = 66,04

S = 0,97

СV = 1,47 %

Ssmir01.wmf = 0,43

smir01.wmf ± Δsmir01.wmf =

66,04 ± 1,20

smir04.wmf = 1,82 %

13,84

69,20

smir01.wmf = 69,20

S = 1,08

СV = 1,55 %

Sx = 0,48

smir01.wmf ± Dx =

69,20 ± 1,34

smir04.wmf = 1,93 %

2

1,0

0,656

65,60

smir01.wmf = 65,60

S = 0,55

СV = 0,84 %

Ssmir01.wmf = 0,25

smir01.wmf ± Δsmir01.wmf =

65,60 ± 0,70

smir04.wmf = 1,07 %

0,67

67,29

x = 67,29

S = 0,31

СV = 0,47 %

Ssmir01.wmf = 0,14

smir01.wmf ± Dx =

67,29 ± 0,40

smir04.wmf = 0,59 %

3

0,5

0,316

63,20

smir01.wmf = 63,20

S = 1,10

CV = 1,74 %

Ssmir01.wmf = 0,49

smir01.wmf ± Δsmir01.wmf =

63,20 ± 1,36

smir04.wmf = 2,15 %

0,33

66,52

x = 66,52

S = 0,45

СV = 0,68 %

Ssmir01.wmf = 0,20

smir01.wmf ± Dx =

66,52 ± 0,56

smir04.wmf = 0,84 %

4

0,1

+

+

Примечание. (+) – количество вещества ниже предела количественного определения.

Таким образом, разработанные методики количественного определения лидокаина и бупивакаина в ткани печени характеризуются удовлетворительной повторяемостью в пределах данной аналитической области по критерию воспроизводимости (стандартное отклонение среднего результата) и позволяют определить 63,20–66,04 % бупивакаина и 69,20–66,52 % лидокаина. При этом граница определения составила 0,5 мкг, а граница обнаружения – 0,1 мкг обоих веществ в 1 г ткани печени.

Выводы

1. Проведена сравнительная характеристика методов выделения исследуемых местных анестетиков из ткани печени. При этом наибольшая степень выделения наблюдается при использовании в качестве извлекателя раствора щавелевой кислоты, рН 2,0. Граница определения составила 0,5 мкг, а граница обнаружения – 0,1 мкг исследуемых веществ в 1,0 г ткани печени.

2. Разработанные методики количественного определения лидокаина и бупивакаина в ткани печени являются валидными по критерию повторяемости результатов измерений в пределах рекомендуемых аналитических областей.

3. Предложенные методики выделения и определения исследуемых местных анестетиков высокочувствительны, селективны и могут быть рекомендованы для проведения судебно-химического (химико-токсикологического) и клинического лабораторного анализов.


Библиографическая ссылка

Смирнова А.В., Фомин А.Н., Семёнов М.Б., Каджоян Л.В. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИДОКАИНА И БУПИВАКАИНА В ТКАНИ ПЕЧЕНИ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА // Успехи современного естествознания. – 2017. – № 12. – С. 16-20;
URL: http://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=36599 (дата обращения: 01.10.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074