Цель исследования
Оценить характер фагоцитарной реакции лейкоцитов периферической крови женщин с вульвовагинальным кандидозом в зависимости от выраженности вирулентно-ассоциированных свойств живых клинических штаммов Candida albicans, от аллельных полиморфизмов локуса DRB1 МНС (HLA) больных женщин и сравнить с аналогичными показателями здоровых лиц.
Материал и методы исследования
Предварительно среди клинических изолятов грибов Candida spp., выделенных от женщин с различной генитальной патологией, были отобраны два экспертных штамма C.albicans как обладающие альтернативными вирулентно-ассоцированными свойствами. Первый экспертный штамм C.albicans-8 характеризовался более высоким вирулентно - ассоциированным потенциалом. Второй экспертный штамм C.albicans-11 характеризовался низким патогенным потенциалом. Объектом исследования служили фагоцитарные клетки, выделенные из венозной крови женщин репродуктивного возраста с ВВК. Полученные фагоциты инкубировали с каждым экспертным штаммом при двух временных режимах (15 и 60 минут). Оценивали фагоцитарную активность соответственно для нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов по следующим показателям: процент фагоцитоза - процент клеток, участвующих в фагоцитозе; индекс адгезии - количество адгезированных бластоконидий C.albicans к одному истинному фагоциту; индекс поглощения - количество поглощенных бластоконидий C.albicans одним истинным фагоцитом. Выживаемость во внеклеточной среде уклонившихся от фагоцитоза клеток Candida рассчитывали по количеству выросших колоний грибов, делая посевы из каждой пробы на плотный агар Сабуро.
Гены DRB1 локуса (13 аллелей) системы МНС (HLA) определяли методом ПЦР («ДНК-технология», Россия). Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия c2. Контрольную группу составляли кадровые доноры русской национальности.
Результаты исследования
Характер фагоцитарной реакции зависел от следующих параметров: 1) состояния здоровья донора лейкоцитов (больные ВВК/ здоровые лица); 2) вида клеток, привлеченных к процессу (нейтрофилы, моноциты, эозинофилы); 3) времени взаимодействия с объектом (15 или 60 минут); 4) характера живого объекта и выраженности его вирулентно-ассоциированных свойств; 5) аллельного варианта локуса DR комплекса HLA больных ВВК женщин.
1. Процент фагоцитоза. Процент нейтрофилов и моноцитов, вовлеченных в фагоцитоз, нарастал с 15 по 60 минуту не зависимо от здоровья донора лейкоцитов и был выше в отношении штамма C.albicans-8 (с более выраженными вирулентно-ассоциироваными свойствами).
2. Индивидуальная активность различных лейкоцитов (средние значения) на разных фазах фагоцитоза:
2.1. Индекс адгезии - отсутствие различий при всех условиях.
2.2. Индекс поглощения нейтрофилами и моноцитами клеток C.albicans возрастал с 15 по 60 минуту (срок наблюдения), был выше у моноцитов, но в 1,5 раза ниже у лейкоцитов от больных ВВК женщин.
3. Выживаемость избежавших фагоцитоза экспертных штаммов C.albicans во внеклеточный бактерицидной среде (среде культивирования фагоцитов с клетками Candida). Выживаемость клеток C.albicans во внеклеточной среде была ниже при культивировании с лейкоцитами больных ВВК по сравнению с лейкоцитами доноров и не зависела от времени контакта: 15 или 60 минут.
4. При анализе генов локуса DRB1 было выявлено достоверное повышение частоты встречаемости гена DRB1*04 у женщин больных ВВК по сравнению со здоровыми лицами (Х2-6,64).
5. Сравнительная оценка фагоцитоза клеток C.albicans лейкоцитами периферической крови DR4+ и DR4- женщин с ВВК показала:
5.1. Процент клеток, вовлеченных в фагоцитоз, не отличался в группах больных DR4+ и DR4- женщин.
5.2. Индексы адгезии и поглощения были достоверно ниже у нейтрофилов и моноцитов DR4+ женщин (таблица 1, 2) не зависимо от вирулентно-ассоциированных свойств грибов.
5.3. Выживаемость клеток C.albicans, избежавших захвата DR4+ фагоцитами, была достоверно ниже, чем выживаемость грибов, избежавших захвата DR4- фагоцитами, не зависимо от выраженности вирулентно-ассоциированных свойств грибов и времени контакта (таблица 3).
Таблица 1. Индекс адгезии экспертных штаммов C.albicans к нейтрофилам и моноцитам DR4+ и DR4- больных ВВК женщин|
Индекс адгезии |
штамм C.albicans-8 |
штамм C.albicans-11 |
|||
|
15 мин |
60 мин |
15 мин |
60 мин |
||
|
Нейтрофилы |
DR4+ |
1,32 ± 0,17 |
0,93 ± 0,13 |
1,11 ± 0,09 |
0,89 ± 0,17 |
|
DR4- |
1,40 ± 0,12 |
1,38 ± 0,16 |
1,31 ± 0,12 |
1,39 ± 0,18 |
|
|
p |
>0,1 |
<0,05 |
>0,1 |
<0,05 |
|
|
Моноциты |
DR4+ |
1,41 ± 0,06 |
1,38 ± 0,10 |
0,93 ± 0,13 |
1,43 ± 0,11 |
|
DR4- |
1,32 ± 0,12 |
1,39 ± 0,12 |
1,43 ± 0,11 |
1,49 ± 0,19 |
|
|
p |
>0,1 |
>0,1 |
<0,01 |
>0,1 |
|
Таблица 2. Индекс поглощения нейтрофилами и моноцитами DR4+ и DR4- больных ВВК женщин экспертных штаммов C.albicans
|
Индекс поглощения |
штамм C.albicans-8 |
штамм C.albicans-11 |
|||
|
15 мин |
60 мин |
15 мин |
60 мин |
||
|
Нейтрофилы |
DR4+ |
0,28 ± 0,05 |
0,74 ± 0,11 |
0,30 ± 0,10 |
0,70 ± 0,12 |
|
DR4- |
0,37 ± 0,06 |
0,64 ± 0,06 |
0,32 ± 0,04 |
0,60 ±0,06 |
|
|
p |
>0,1 |
>0,1 |
>0,1 |
>0,1 |
|
|
Моноциты |
DR4+ |
0,10 ± 0,05 |
0,43 ± 0,06 |
0,09 ± 0,05 |
0,43 ± 0,08 |
|
DR4- |
0,28 ± 0,07 |
0,43 ± 0,08 |
0,29 ± 0,10 |
0,43 ± 0,06 |
|
|
p |
<0,1 |
>0,1 |
<0,1 |
>0,1 |
|
Таблица 3. Выживаемость клеток C.albicans, избежавших фагоцитоза при контакте с лейкоцитами DR4+ и DR4- больных ВВК женщин
|
% выживших грибов |
штамм C.albicans-8 |
штамм C.albicans-11 |
||
|
15 мин |
60 мин |
15 мин |
60 мин |
|
|
DR4+ |
34,68 ± 4,44 |
36,86 ± 6,73 |
46,39 ± 11,29 |
38,67 ± 5,07 |
|
DR4- |
65,26 ± 10,26 |
80,59 ± 10,09 |
70,07 ± 12,23 |
55,77 ± 7,45 |
|
p |
<0,01 |
<0,001 |
>0,1 |
<0,1 |