Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

Гемоглобины человека изучаются уже на протяжении почти века, но, тем не менее, эмбриональный гемоглобин (HbP, синоним - HbE) является одним из самых малоизученных белков человеческого организма. Сведения о HbP в научной литературе до сих пор крайне скудны. Такой парадоксально низкий интерес ученых к этому белку можно объяснить следующими причинами: а) методологический фактор: получение препарата HbP крайне затруднительно из-за сложностей получения биоматериала (HbP синтезируется только в раннем эмбриогенезе, с 5 по 18 гестации), экстрагирования и очистки белка; б) практический фактор: по мнению большинства клиницистов, данный белок не представляет прикладной (диагностическо-прогностической) ценности, т.к. активность его гена полностью репрессирована как у детей, так и у взрослых [1, 2, 3, 6].

В данной работе авторы исходили из предположения, что активация ε-гена HbP в постнатальном периоде жизни человека возможна при патологии, связанной с понижением степени дифференцировки, т.н. «омоложением» клеток эритроцитарного ростка [4]. К таким состояниям можно отнести некоторые онкологические заболевания тканей красного костного мозга, в первую очередь, эритремии, сублейкемические миелозы, а также, возможно, некоторые миелолейкозы.

Цель исследования - иммунохимический качественный анализ наличия эмбрионального гемоглобина в эритроцитах больных эритромами, сублейкемическими миелозами и лейкозами различных типов.

В процессе научно-экспериментального исследования физико-химических свойств эмбрионального гемоглобина авторами разработан оптимальный алгоритм выделения этого белка [4].

Исходным биоматериалом для выделения и очистки HbP служил абортивный материал сроком 7-9 недель (отделение неонатологии больницы №5 г. Астрахани). После промывки и сортировки эмбриональные ткани подвергались механически-термической гомогенизации. После экстрагирования цитозольных белков проводили, взвесь центрифугировали при 8000 g в течение 30 мин, после чего осадок отбрасывали. Поскольку устойчивость эмбрионального гемоглобина несколько ниже, чем у фетального [6], для очистки HbP нами была модифицирована стандартная методика щелочной денатурации для выделения фетального гемоглобина [3, 6], состоящая в 40-секундной обработке смеси 1,2 М раствором NaOH, с последовательным осаждением белков раствором сульфата аммония (до 50%-й насыщенности). После центрифугирования при 8000 об/мин в течение 30 мин осадок отделяли. В надосадочной жидкости оставался эмбриональный гемоглобин с незначительным количеством белковых примесей. Полученный белковый препарат подвергали обессоливанию путем гель-проникающей хроматографии на колонке с сефадексом G-25, рабочий буфер - 0,05 М фосфатный буферный раствор рН 7,4. Окончательную очистку HbP от оставшихся щелочеустойчивых компонентов в полученном на предыдущем этапе препарате проводили путем ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе G-50 на 0,01 М трис-хлоридном буфере рН 8,1 в градиенте ионной силы.

Анализ чистоты полученных препаратов осуществляли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле.

Полученные очищенные препараты HbP использовали, в частности, для получения специфических антисывороток на данный белок методом иммунизации кроликов. Иммунизация проводилась с полным адьювантом Фрейнда по стандартной методике [5]. Для контроля качества антисывороток проводили их иммунохимическое сопоставление с другими антигенными композитами, а также специфическую окраску полученных преципитатов бензидиновым методом [6]. При наличии дополнительных линий преципитации проводили дробное истощение антисыворотки соответствующей белковой фракцией. В результате проведенной работы разработаны специфические иммунохимические тест-системы на эмбриональный гемоглобин, в которой тест-антигеном является очищенный препарат HbР (полученный вышеописанным способом) в рабочем разведении: 1/2 или экстракт тканей эмбриона (срок - 6-9 недель) в рабочем разведении 1/8-1/16. Тест-системы на использовали для иммунохимической индикации HbP в исследуемом материале.

Объектом нашего исследования являлась гепаринизированная кровь больных некоторыми гематологическими онкозаболеваниями. Всего было обследовано 107 образцов крови. Из них: 12 больных эритромами, 11 больных сублейкемическими миелозами, 31 больных острыми и хроническими миелолейкозами, 17 больных острыми и хроническими лимфолейкозами, а также 36 образцов крови здоровых людей (группа контроля) (табл.1).

Сбор биоматериала проводили в гематологическом отделении 1-й областной больницы г. Астрахань.

Подготовка проб к анализу состояла в их предварительном гемолизе путем двухкратного замораживания (при -18⁰С) и оттаивания.

Таблица 1 Перечень использованного в работе материала

Индикация HbP в образцах осуществлялась путем иммунодиффузии по Оучтерлони [5]. В ходе работы использовались моновалентные иммунохимические тест-системы на HbP (см. выше).

После иммунопроявления агаровые стекла высушивали и подвергали специфическому окрашиванию на гемоглобины гваяколовым методом, модифицированным авторами: 0,2 г гваякола в 50 мл ледяной уксусной кислоты, затем добавляли этот раствор в 0,1М ацетатный буфер рН 4,6 с 0,2% хлоридом марганца (II) до 0,3% концентрации. Туда же добавляли перекись водорода до концентрации 1%. Экспозиция 45 мин. В результате окраски гемоглобиновые преципитаты приобретали голубой цвет.

Стекла фотографировали в отраженно-рассеянном свете. Считывание результатов проводили только по отчетливым окрашенным линиям преципитации.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием статистических компьютерных программ.

В результате проведенного иммунохимического анализа исследуемого материала на эмбриональный гемоглобин методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони получены следующие результаты (табл. 2).

Как видно из приведенных данных, эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремиями, хроническими эритромиелозами, сублейкемическими миелозами и острыми миелолейкозами. Эти данные свидетельствуют о возможности дерепрессии гена ε-протомера (гена эмбрионального гемоглобина) при снижении дифференцировки клеток эритроцитарного ростка, сопровождающей онкологические заболевания данной ткани. Нулевая выявляемость HbP в крови гематологических больных с онкопатологией неэритроидного генеза (острые и хронические лимфолейкозы) согласуется с приведенной версией.

Таблица 2 Результаты иммунохимической индикации HbP в крови онко-гематологических больных

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что иммунохимическая индикация эмбрионального гемоглобина в крови гематологических больных способствует повышению качества дифференциальной диагностики ряда онко-гематологических заболеваний.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. - СПб, ООО "ЭЛБИ-СПб", 2000. - 384 с.
2. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы патохимии - СПб. «Элби-СПб». - 2000. - 182 с.
3. Карпищенко А.И. - Медицинские лабораторные технологии и диагностика / А.И. Карпищенко. - Справочник, т 1, С. Петербург, 1998. - 144 с.
4. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Семенова Т.Б. - Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С.58-62.
5. Никулина Д.М. - Практическое освоение иммунохимических методов / Метод. рекомендации. - Астрахань, - 1996. - 36 с.
6. Стародуб Н.Ф., Назаренко В.И. - Гетерогенная система гемоглобина: структура, свойства, синтез, биологическая роль / АН УССР, Институт молекулярной биологии и генетики. Киев: Наукова думка, 1987. - 198 с.