Коммерческие препараты фицина получают из незрелых плодов F. сarica. При выращивании каллуса этого растения выявлена протеаза, похожая на фицин. В опытах изучено влияние различных сочетаний фитогормонов на протеолитическую активность каллуса F. carica. Результаты данных исследований позволяют наметить пути использования этого метода в контролируемом производстве фицин-содержащего сырья.
Ранее нами было проведено изучение протеолитической активности латекса F. carica, которая составила 213 γ/мл. Использованный нами метод, его авторами был разработан при изучении протеаз Carica papaya. Поскольку фицин является цистеиновой протеазой, при определении протеолитической активности в плодах Ficus carica в реакционную смесь вносили активирующие добавки: цистеин-HCl, в концентрации 5·10⁻²М и ЭДТА - 2 ·10⁻².
Определена оптимальная величина pH при выявлении максимальной протеолитической активности. При pH 6,5 она составила 207, 98; при pH 8,0 - 225,35; при pH 9,0 - 187,79. Таким образом, оптимум протеолитической активности проявился при pH 8,0.
Представляется целесообразным продолжить ранее проводимые исследования. Предварительные результаты исследований показывают, что для получения каллусной ткани F. carica in vitro можно использовать его соплодия на ранних стадиях развития (до 2 см). Эти данные полезны в плане разрабатываемой технологии, так как пока не выяснено из какой ткани более интенсивно идет накопление исследуемого ингредиента: в каллусной массе или в цветочных структурах.
Были испытаны следующие сочетания регуляторов роста:
- 0,3 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК) + 3,0 мг/л бензиламинопурина (БАП);
- 0,3 мг/л индолил-пировиноградной кислоты (ИПК) + 3,0 мг/л 6БАП;
- 0,3 мг/л ИУК + 0,3 мг/л ИПК + 3,0 мг/л 6БАП, на фоне 2 прописей макросолей:
а) по АС № 1608845 /2/
б) по Мурасиге-Скугу /5/
По АС № 1608845 получен светло-зеленый каллус, по Мурасиге-Скугу - темно зеленый. Наилучшая приживаемость отмечена на среде по АС № 1608845 при введении смеси ауксинов (ИУК+ИПК) и БАП и составила 88%, что согласуется с данными об активации ауксинов индолил-ПВК при укоренении древесно-декоративных растений.
В опытах установлено ускорение нарастания каллуса при добавлении к ауксинам 2,4-Д, в концентрации 2 и 5 мг/л. Как показали результаты исследований, наиболее интенсивное нарастание каллуса происходило на среде с 5 мг/л 2,4 Д; 0,5 кинетина и 10 - ИУК, наиболее слабое - при исключении ИУК и уменьшении концентрации 2,4 Д. При проведении опытов с активированным углем через 28 дней отмечено увеличение массы каллуса до 546 мг на пробирку против 526 мг в контроле. Деление каллуса проводили на 2-3 части и высаживали на среду, в одну колбу. В течение двух месяцев нарастания каллус срастался, образуя один конгломерат неправильной формы. Предстоит изучить минимальную массу каллуса при его пассажах, которая обеспечивает жизнеспособность каллусной ткани.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Отработана методика введения в культуру in vitro тканей растений F. carica. Изучено влияние различных вариантов питательных сред на скорость нарастания каллуса. Получены стерильные культуры каллуса F. carica сорта Лардаро, в количестве, достаточном для получения суспензионной культуры клеток. Проведено изучение протеолитической активности незрелых плодов и выделен ферментный препарат. Оптимизированы условия питания стеблевых верхушек и получены стерильные растения, пригодные для разработки методики микроразмножения в культуре in vitro. Отработана методика акклиматизации растений при переводе в культуру in vivo.