В связи с этим нами исследована структура активных центров и кинетика действия ряда гликозидаз: инулиназы, b-фруктофуранозидазы, b-галактозидазы, что позволило выявить общие закономерности катализируемых ими реакций и развить идею об идентичности механизма расщепления гликозидных связей в олиго- и полисахаридах.
Установлено, что каталитически активными группами в исследованных нами карбогидразах являются карбоксильная группа либо аспарагиновой, либо глутаминовой аминокислот и имидазольная группа гистидина Наличие в каталитических центрах карбогидраз карбоксильной и имидазольной групп дает основание считать, что механизм расщепления гликозидных связей в олиго- и полисахаридах этими ферментами идентичен.
Особенности строения активных центров исследуемых ферментов, проявляются в их субстратной специфичности, в частности по отношению к длине субстрата.
Как истинная галактозидаза, b-галактозидаза Penicillium canescens специфична к гликоновой части молекулы субстрата и проявляет меньшую специфичность к агликону.
Специфичность и характер действия фруктозидаз были исследованы в реакциях гидролиза различных фруктозосодержащих поли- и олигосахаридов. Установлено, что инулиназа Aspergillus awamori и кроме инулина способна гидролизовать стахиозу, раффинозу, сахарозу и леван, то есть проявляет химическое сродство как к b-2,1-, так и b-2,6-фруктозидной связи в олигофруктозидах. Анализ продуктов гидролиза субстратов инулиназой из A. awamori методом ВЭЖХ показал, что основным продуктом этой реакции является фруктоза, и фермент относится к экзо-действующим гликозидгидролазам. Активность экзо-инулиназы A. awamori по отношению к левану и b-2,6-фруктоолигосахаридам со степенью полимеризации 3 - 6 выгодно отличает ее от других инулиназ, однако скорость гидролиза левана существенно ниже, чем скорость гидролиза инулина, что объясняется различиями в пространственной структуре этих фруктанов.
Для того, чтобы выяснить, с какими особенностями в молекулах дрожжевых b-фруктозидаз связаны их инвертазная и инулиназная активности, исследовали способность b-фруктозидазы Kluyvermyces marxianus к гидролизу различных фруктоолигосахаридов. Полученная высокоочищенная b-фруктозидаза также гидролизовала наряду с сахарозой раффинозу, стахиозу, инулин и леван. При кислотной и термической инактивации отношение инулазной активности (I) фермента к инвертазной (S) было постоянной величиной. Способность гидролизовать леван отмечена и для некоторых других инвертаз. Проявление активности фермента по отношению к левану заслуживает особого внимания, так как даже многие инулиназы не гидролизуют данный полисахарид. Способность гидролизовать любой субстрат с b-фруктозидной связью не является очевидной особенностью каждой b-фруктозидазы.
Таким образом, изучение структуры активных центров карбогидраз и субстратной специфичности их действия позволило выявить общие закономерности катализируемых ими реакций.