Известно, что опиоидные пептиды имеют отношение к регуляции функций пищеварительной системы [1,2]. Исследованиями, проведенными ранее, показано, что нейропептиды участвуют в морфофункциональной перестройке органов желудочно-кишечного тракта, а также в реализации цитопротекторного эффекта в отношении слизистой желудка и кишечника
[3,5]. Среди значительного числа нейропептидов наиболее подробно в эксперименте изучены даларгин и мет-энкефалин [1,2,3,4]. Полученные результаты позволили установить участие упомянутых опиоидов в контроле темпа синтеза и секреции слизистого компонента желудочного и дуоденального содержимого для неизмененной слизистой [4].
Настоящее исследование посвящено сравнительному изучению влияния даларгина на секреторные эпителиоциты слизистой оболочки ДПК при наличии дуоденальной язвы.
Материал и методы
Обьектом исследования послужила слизистая оболочка двенадцатиперстной кишки крыс-самцов линии Вистар. Животные были разделены на три экспериментальные группы. Первая - контрольная группа, вторая - это животные, которым вводили даларгин парентерально каждые 12 часов в дозе 24 мкг/кг массы тела. Животных этой группы забивали на 1-ые, 2-ые, 4-ые и 7-ые сутки. Третья группа - это крысы с экспериментально воспроизведенной язвой ДПК, для чего использовали цистеамингидрохлорид по модифицированному методу Сабо [9]. На фоне развившейся язвы животным подкожно вводили даларгин ( так же каждые 12 часов ). Животных забивали на 1-ые, 2-ые и 3-тьи сутки. Кусочки слизистой оболочки ДПК фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин по обычной методике. Для выявления муцинов использовали комплекс гистохимических методов, включающий аналитические и ферментативные обработки [8]. Выявленные вещества типировали по схеме, предложенной М.Г.Шубич и Г.М.Могильной [7]. Трефоиловые пептиды выявляли после окисления срезов перманганатом с последующим обнаружением дисульфидных групп цистина окраской основным коричневым при рН 1,0 [6 ].
Результаты и их обсуждение
Гистохимическое изучение слизистой оболочки ДПК контрольных животных показало, что при окрашивании по методу ШИК интенсивную реакцию обнаруживают секрет каемчатых энтероцитов и бокаловидных гландулоцитов (БГ). При этом интенсивность окрашивания БГ определяется количеством содержащегося в них секрета. Так для клеток с умереннем уровнем его содержания характерно наличие вакуолизированного секрета с окраской оболочек вакуолей и их содержимого. С падением степени интенсивности окрашивания реакцию сохраняют только оболочки вакуолей. БГ с высоким содержанием секрета обычно окрашиваются диффузно и интенсивно. Отношение ШИК-реакции к диастазе, мягкому кислотному гидролизу и фенилгидразину позволяет считать, что в состав секрета входят нейтральные муцины, уровень содержания которых нашел отражение в показателе среднего цитохимического коэффициента ( СЦК). При этом БГ ворсинок у животных контрольной группы имеют СЦК , равный 2,3±0,08 , а БГ крипт - 2,19±0,07. ШИК-реактивность БГ была использована нами и для количественной характеристике их числа в составе ворсинок и крипт.
При выявлении кислых муцинов в окраске альциановым синим при рН 2,7 оказалось, что секрет БГ и каемка кишечных энтероцитов окрашиваются умеренно, а местами - слабо. Средний цитохимический коэффициент для альцианофильных БГ ворсинок оказался равным 1,19±0,02, а для БГ крипт - 1,2±0,02. Кислые муцины с ионизированными сульфатными группами в окраске альциановым синим рН 1,0 выявлялись лишь в секрете БГ крипт, уровень содержания их от низкого ( СЦК 0,71±0,11 ) до следов. При избирательном выявлении трефоиловых пептидов установлено, что положительную реакцию обнаруживает секрет БГ ворсинок и крипт, интенсивность реакции у некоторых животных от слабой до умеренной, а у других от умеренной до интенсивной, распределение продукта реакции диффузное.
При изучении влияния даларгина на неизменную слизистую оболочку ДПК оказалось, что содержание нейтральных муцинов в секрете бокаловидных гландулоцитов ворсинок практически не меняется и средний цитохимический коэффициент в окраске по методу ШИК для этих клеток составляет 2,33±0,08, соответствуя уровню контроля . БГ крипт в ответ на введение даларгина в течении 1-х суток реагируют снижением уровня содержания нейтральных муцинов, что находит отражение в уменьшении их СЦК. Так, в контроле СЦК этих клеток составляет 2,19±0,07, после введения даларгина - 1,85±0,1 ( р < 0,01). На 2-е сут введения даларгина содержание нейтральных муцинов в БГ ворсинок и крипт увеличивается. Однако наиболее выраженное увеличение темпа синтеза этих веществ приходится на 4-ые сут введения даларгина. В эти сроки в интактной слизистой оболочке активируется деятельность БГ с возрастанием их СЦК, 2,52±0,04 - для БГ ворсинок, и 2,69±0,05 - для БГ крипт. Изменение СЦК приводит к перераспределению типов БГ, и, следовательно, к изменению обьема секретируемой слизи. Кислые муцины в 1-ые и 2-ые сут введения даларгина исчезают из состава секрета БГ и появляются в них лишь на 4-ые сут, к этому сроку число альцианофильных БГ возрастает в 1,5 раза. К 7-м суткам эксперимента и число БГ и уровень содержания в них кислых муцинов - снижаются.
Влияние даларгина на пролиферативный статус слизистой находит отражение в числе БГ в составе ворсинок и крипт (рис.1). Оказалось, что увеличение количества БГ регистрируется на 4-ые сут введения препарата, но статистически это увеличение недостоверно. Выявленные изменения могут быть охарактеризованы как тенденция к увеличению числа БГ , ибо статистически достоверное ( р< 0,001) увеличение оказалось характерно лишь для БГ крипт. При изучении распределения трефоиловых пептидов отмечается некоторое снижение уровня их содержания, наиболее заметное к 4-ым сут введения даларгина.
На фоне развившейся экспериментальной язвы эффект даларгина может быть оценен в двух аспектах: во-первых, с позиции сформированного язвенного фона, который развивается к концу первых суток введения цистеамина, а во-вторых - это изменения, разыгрывающиеся при введении даларгина при неизмененной СО ДПК. В первом случае оказалось, что введение цистеамина индуцирует увеличение темпа синтеза нейтральных и кислых муцинов БГ ворсинок и крипт. При этом БГ увеличивают показатель СЦК. Так, если в контроле он составлял 2,3±0,08 усл.ед., то к концу первых суток эксперимента с цистеамином СЦК оказался равным 3,65 ± 0,09 статистически достоверно ( р < 0,001) превышая исходный уровень.
Аналогичное повышение темпа синтеза нейтральных муцинов имело место и в БГ крипт. Кислые муцины, выявляемые в окраске альциановым синим при рН 2,7 в течение первых суток формирования экспериментальной язвы так же увеличивали темп синтеза. Введение даларгина на фоне язвы ДПК в течении первых суток сохраняет высокий темп синтеза муцина в БГ и ворсинок, и крипт и этот темп синтеза сохраняется до конца 3-тьих суток эксперимента, эта динамика находит отражение в увеличении показателя СЦК и в показателях общей муцинпродуцирующей активности секреторных эпителиоцитов. Увеличивается и синтез кислых муцинов. Так, БГ ворсинок контрольных животных после окраски альциановым синим рН 2,7 имели СЦК равный 1,19 ± 0,02, а после введения даларгина их СЦК возрастает ( р < 0,001) и остается повышенным до конца 3-х суток. Муцинпродуцирующая активность БГ на фоне введения даларгина возрастает почти в 2 раза. Исходный уровень МПА, равный 60,56±4,01 к 3-м суткам составляет для ворсинок 110,2 ±0,75, а для БГ крипт 53,1±0,67 ( при 48,18±2,02 в контроле ). Участие даларгина в регуляции пролиферативной активности БГ при наличии экспериментальной язвы ДПК выявляется на фоне контроля для цистеамина. Так, к концу 1-х сут введения цистеамина число БГ в составе ворсинки соответствует 15,8±2,01 , а в зоне крипты - 17,3±1,8. Введение даларгина приводит к увеличению числа БГ ворсинок и к концу первых суток их становится 21,22±3,97. В то же время в зоне крипт их количество соответствует исходному, а при введении даларгина в течение 1-3 суток даже несколько снижается. При введении даларгина животным контрольной группы оказалось, что существенные сдвиги в уровне распределения нейтральных муцинов в интактной слизистой регистрируются у них лишь на 4-е сут эксперимента, когда происходит увеличение СЦК ворсинок и на этом фоне - увеличение общей муцинпродуцирующей активности, к этому сроку увеличивается темп синтеза нейтральных муцинов и в бокаловидных гландулоцитах зоны крипт.
Интересно отметить характерное для этой группы животных увеличение на фоне введения даларгина общего числа БГ, содержащих кислые муцины. Так до введения даларгина у животных контрольной группы число БГ, содержащих кислые муцины, в среднем составило 19,1±0,68. При этом увеличение темпа синтеза этих веществ для БГ ворсинок приурочено к 4-ым и 7-ым суткам, а для БГ крипт -к 4-ым сут эксперимента. Изучение уровня содержания трефоиловых пептидов в зоне ДПК на фоне экспериментальной язвы с последующим введением даларгина показало, что спустя 24 часа после введения цистеамина каемка кишечных энтероцитов и секрет БГ ворсинок и крипт окрашиваются умеренно или интенсивно. Введение даларгина в эти же сроки приводит к падению содержания в секреторных эпителиоцитах ДПК трефоиловых пептидов. Пролонгирование срока введения даларгина до 2-х и 3-ех суток сопровождается восстановлением уровня содержания трефоиловых пептидов к исходному.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют , что опиоидные пептиды являются регуляторами эпителиального гомеостаза желудочно-кишечного тракта. При этом влияние даларгина на неизмененную слизистую оболочку ДПК прослеживается в увеличении числа БГ в эпителиальной выстилке ворсинок и крипт, а так же в сдвигах темпа синтеза муцинов, продуцируемых БГ. Причем во временном аспекте эти изменения различны. Так, продукция нейтральных муцинов увеличивается к 4-м сут введения даларгина и удерживается до 7-х сут, а кислых - к 4-м сут, но снижается к 7-м. В то же время введение даларгина на фоне экспериментальной язвы ДПК приводит к выраженной фазной динамике, которая инициируется изменением исходного темпа синтеза муцинов БГ ворсинок и крипт на фоне введения цистеамина. Так оказалось, что к моменту формирования язвы ДПК на фоне снижения числа БГ происходит активация темпа синтеза этими клетками муцинов и трефоиловых пептидов и этот высокий темп удерживается за счет введения нейропептида в основном БГ ворсинок при всех последующих сроках эксперимента. На фоне сформированной язвы ДПК введение даларгина влияет на механизм регуляции и темпа синтеза муцинов, и темпа пролиферации. При этом выявленное увеличение числа секреторных БГ в составе эпителиальной выстилки ворсинок находит отражение в нарастании и муцинпродуцирующей активности (МПА), ибо на фоне экспериментальной язвы ДПК без даларгина она составила для БГ ворсинок 57,7±0,95 усл.ед., увеличиваясь почти в 2 раза к 3-м сут введения даларгина. В то же время БГ крипт на фоне экспериментальной язвы не реагируют на даларгин в течение первых 3-х суток его введения. Таким образом, полученные данные позволяют считать, что даларгин играет важную роль в регуляции темпа синтеза слизистого компонента дуоденального секрета и, следовательно, в реализации эпителиоцитами ДПК эффекта цитопротекции слизистой
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
- Виноградов В.А., Полонский В.М. Даларгин - наиболее активный синтетический аналог эндогенных опиоидов для лечения язвенной болезни // Бюллетень Всесоюзн. корд. науч. центра. - 1986. - № 2. - С. 62-63.
- Зверков И.В., Арндт И.П., Щербаков Н.В., Смагин В.Г. Гастроинтестинальные эндокринные клетки при лечении больных дуоденальной язвой новым пептидным препаратом даларгином// Бюллетень Всесоюзн. корд. научн. центра. - 1986. - № 2. - С. 72-74.
- Лукаш Н.В., Полищук Т.Ф. Влияние тималина, даларгина и «мукозалина» на течение экспериментальной язвы двенадцатиперстной кишки // Врачебн.дело. - 1995. - № 1-2. - С. 53-54.
- Могильная Г.М., Коротько Г.Ф., Курзанов А.Н. Динамика цитохимических свойств защитного барьера желудка при введении даларгина // Морфология. - 1996. - № 3. - С. 72-75.
- Смагин В.Г.. Виноградов В.А., Булгаков С.А., Полонский В.М. и др. Клиническая оценка гексапептида даларгина как средства лечения язвенной болезни двенадцатиперстной кишки // Тер.архив . - 1984. - v.11. - С. 49-52.
- Шубич М.Г. Методика гистохимического выявления белков, богатых цистином // В кн.: Доклады научной сессии Куб.мед.института. - Краснодар. - 1963. - С. 94-95.
- Шубич М.Г., Могильная Г.М. Значение ШИК-метода в гистохимическом анализе углеводных и углеводсодержащих биополимеров // Архив анат., гистол. и эмбриол. - 1982. - № 5. - С. 90-93.
- Pearse A. Histochemistry.Theoretical and applied.- London. - 1968.- v. 1 .- 213 p.
- Szabo S. Am. J. Path. - 1978. - v. 93. - p. 273- 276.