Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

Данная работа является фрагментом исследований по генетическому полиморфизму цитокинов и направления «HLA и болезни» Научно-учебного Центра Молекулярной иммуногенетики УРО РАН/ ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет»/ ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови».

Ревматоидный артрит - хроническое системное заболевание соединительной ткани, клинически проявляющееся прогрессирующим поражением преимущественно периферических суставов по типу эрозивно-деструкивного полиартрита [1].

Ревматоидный артрит - мультифакторное заболевание, патологический процесс которого характеризуется дисбалансом противовоспалительных цитокинов со сдвигом в сторону провоспалительных цитокинов, среди которых большое значение отводится фактору некроза опухолей α (TNFα) [4]. Участие TNFα в развитии предрасположенности и клинических вариантах РА ведется в направлениях оценки содержания TNFα в сыворотке и синовиальной жидкости больных РА, уровня экспрессии м-РНК для TNFα и изучения полиморфизма гена TNFα [3].

Ген TNFα - один из самых полиморфных генов цитокинов, располагается в теломерной части шестой хромосомы в составе генов главного комплекса гистосовместимости (HLA III класса) и характеризуется высоким количеством SNPs  в промоторной области, наиболее известными являются положения - 308, -238. Однако, есть и другие полиморфизмы типа SNP, например, -863, способные также влиять на экспрессию TNFα. Данные о влиянии SNPs -308,-238, -863 на  экспрессию и на предрасположенность и клинические варианты РА спорны: существуют исследования, в которых показана связь этих полиморфизмов и предрасположенности и тяжести течения РА,  и есть работы опровергающие роль SNPs -308, -238, -863 при РА [2, 3, 4].

Цель исследования: оценка распределения частот аллельных вариантов, генотипов и сочетаний генотипов полиморфизма типа SNP  в точках -863, -308, -238 промотора гена TNFα у здоровых лиц и больных ревматоидным артритом русской этнической группы Челябинской области.

Задачи исследования:

1. Установить распределение аллелей и генотипов в выборках здоровых лиц и больных РА в зависимости от клинического варианта РА (серопозитивный, серонегативный) РА с системными проявлениями и без них, и возраста начала РА русской этнической группы.
2. Оценить частоты сочетаний генотипов исследуемых полиморфизмов гена TNFα в выборках больных РА и здоровых лиц.
3. Оценить шансы возникновения заболевания в зависимости от носительства определенного аллеля, генотипа или комбинации генотипов.

Материалы и методы

Отбор пациентов (92 человек) проводился на кафедре госпитальной терапии Челябинской Государственной Медицинской Академии и в ревматологическом отделении Городской клинической больницы №6 (ГКБ№6) вне зависимости от стадии, клинического варианта течения заболевания и возраста начала РА. Выборка больных РА характеризовалась следующими показателями: 14 человек с системными проявлениями, полиартрит у 78 человек, серопозитивный вариант - 78, серонегативный - 16, средний возраст начала - 40,5 лет±1,5.

Контрольная группа (212 человек) составлялась из кадровых доноров костного мозга ОГУП Челябинской областной станции переливания крови. Принадлежность к этнической группе определялась по данным генеалогического анамнеза в третьем поколении (согласно рекомендациям 8-го Международного Симпозиума в 1980г., Лос-Анджелес, США). Типирование SNPs  в гене TNFα - ПДРФ - анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов: амплификация с последующей обработкой ампликонов эндонуклеазами рестрикции NcoI   для положения -308 (G/A), BamHI для положения -238 (G/A) при 37°С, TaiI для положения -863 при 65°С. Детекция результатов - электрофорез в 8% ПААГе. Статистическая обработка результатов: иерархический логлинейный анализ для расчета критерия максимального правдоподобия (G или χ²_ML) и отклонений Фримана-Тьюки, позволяющие определить  за счет каких ячеек таблиц сопряженности может получаться значимый эффект или тенденция к различиям. Критерий хи-квадрат с поправкой Йетса на непрерывность применялся для одной степени свободы, когда абсолютные частоты меньше 10. Для оценки вероятности возникновения признака (заболевания или какой-то клинической характеристики) в зависимости от генетического варианта (аллеля, генотипа, комбинации генотипов) применялся критерий отношения шансов (ОШ) с расчетом 95% ДИ - отношение шансов в одной группе к шансам этого же событии в другой группе. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р≤0,05, незначимыми при р>0,10; для промежуточных значений р (0,05≤р≤ 0,10) обсуждали тенденцию к различиям.

Результаты исследования

Распределение частот генотипов SNPs -308, -238, -863 TNFα в исследуемых выборках подчинялось закону Харди-Вайнберга.

1. Анализ распределения аллелей и генотипов SNPs -308, -238, -863 TNFα в группе здоровых лиц русской этнической группы Челябинской области. В целом распределение аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов соответствует частотам распределения в европеоидных популяциях, хотя имеются этнические особенности в распределении аллелей и генотипов -308 SNP. По частотам аллелей и генотипов SNPs -238, -863 представители русской этнической группы не отличаются от других популяций европеоидного происхождения [2, 5].

2. На втором этапе мы изучали распределение частот аллелей и генотипов в выборке больных РА в сравнении со здоровыми лицами и внутри группы больных. По частотам аллелей -238, -308 выборки больных РА и здоровых лиц не отличаются между собой. В группе больных РА наблюдалось повышение частоты аллеля с заменой -863 на уровне тенденции:19,57% против 14,39% в группе сравнения, χ²_ML=2,56, р=0,109, одна степень свободы,  FT для аллеля с заменой составляет 1,216, что соответствует р<0,05, а по критерию ОШ полученные различия не были статистически значимыми ОШ=1,45; 95% ДИ [0,92;2,5]. При выделении отдельно группы женщин, больных РА эта тенденция усилилась (χ²_ML=2,879, р=0,089, одна степень свободы, FT для аллеля с заменой составляет 1,14, р<0,05, а для частого аллеля FT равно -1,016, р<0,05, хотя по критерию ОШ различия также были статистически недостоверны ОШ=1,64, 95% ДИ [0,92;2,89]). Возможно, установленный феномен не имеет прогностического значения в отношении развития РА.

Для частот генотипов -863, как и для частот генотипов -238, -308, не получено статистически значимых отличий между выборкой больных РА и группой сравнения.

В продолжение работы мы провели анализ распределения частот аллелей и генотипов внутри группы больных в зависимости от возраста начала РА, клинических вариантов (серопозитивный, серонегативный) и по наличию или отсутствию системных проявлений. Не обнаружено различий для исследуемых полиморфизмов в группах больных с ранним и поздним РА, с серопозитивным и серонегативным вариантом РА.

Для  группы больных с системными проявлениями значим оказался полиморфизм SNP -308, полученные данные приведены в таблице. Как видно из таблицы частоты аллеля с заменой и его гомозиготного и гетерозиготного генотипов повышены в группе больных с системными проявлениями, в то время как снижены частоты аллеля дикого типа и его гомозиготного генотипа. Критерий ОШ показал, что высокопродуктивный аллель (A) с заменой и его гетерозиготный вариант (G/A) предрасполагают к возникновению системных проявлений у больных РА, а аллель нормальной продукции (G) является протекторным для развития системных осложнений.

Таблица 1. Распределение аллелей и генотипов SNP -308 в группах больных РА с системными проявлениями и без них.

*  - χ² с поправкой Йетса, для одной степени свободы.

3. На третьем этапе работы были изучены комбинации генотипов исследуемых полиморфизмов  и их сочетанное влияние на состояние «больной РА - здоровый индивид». Поскольку эти полиморфизмы располагаются в промоторной области гена то, предположительно, могут сочетано влиять на уровни экспрессии белка [5]. При изучении взаимодействий между SNPs -308, -238, -863 и состояния «больной РА - здоровый индивид» значимо оказалось взаимодействие между генотипами SNP -308 и генотипами -863, выражающееся в повышенной частоте сочетания G/A(-308)-C/A(-863)  в группе больных РА, по сравнению со здоровыми лицами (13,04% против 2,83%, общий χ²_ML= 10,160, р=0,11808, 6 степеней свободы, отклонения Фримана-Тьюки в группе больных РА 1,78, в группе контроля - -1,68, р<0,05; для одной степени свободы χ² с поправкой Йетса  =10,25, р=0,0014; ОШ=5,15, 95% ДИ [1,86;14,24]).  Это сочетание содержит аллели с заменами точке -308 (А) и в точке -863 (А), при этом влияние замен  на экспрессию TNFα, согласно литературным данным противоположно: аллель А -308 повышает продукцию TNFα, тогда как аллель А -863 снижает ее [5]. К настоящему времени мы не можем объяснить этот феномен, вероятно, что это сочетание может быть связано с другими полиморфизмами в гене TNFα, или входить как часть в расширенные гаплотипы HLA.

Выводы:

1. Установлены характеристики распределения аллелей и генотипов полиморфизмов типа SNPs -238, -308, -863 у представителей русской этнической группы Южного Урала.
2. Показано повышение частот аллелей с заменами в точке -863 (на уровне тенденции) в группе больных РА и у женщин больных РА, не имеющее диагностического значения.
3. SNPs -238, -308, -863 не связаны с предрасположенностью, клиническими вариантами (серопозитивный, серонегативный) и возрастом начала РА.
4. Значим для формы РА с системными проявлениями, оказался полиморфизм -308 G/A: повышена частота аллеля с заменой (А) и его гомозиготного (А/А) и гетерозиготного генотипов (G/A).
5. В общей группе больных РА повышена частота сочетания генотипов G/A(-308)-C/A(-863).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Шулутко Б.И., Курдыбайло Ф. В., Настин Н.Н и др. Внутренние болезни, т. 2. // СПб.: Изд-во Санкт-Петербургского санитарно - гигиенического мед. института, 1994. - 480с.
2. Brinkman B.M., Huizinga T.W., Kurban S.S., et al. Tumour necrosis factor alpha gene polymorphisms in rheumatoid arthritis: association with susceptibility to, or severity of, disease?// Br J Rheumatol. - 1997. -Vol. 36. - P.516-521.
3. Fonseca J. E., Cavaleiro. J. et al. Contribution for new genetic markers of rheumatoid arthritis activity and severity: sequencing of the tumor necrosis factor-alpha gene promoter //Arthritis Research & Therapy. - 2007. - Vol.9. - P.1-10.
4. Kaijzel E.L., Bayley J-P., et al. Allele-specific quantification of tumor necrosis factor (TNF) transcription and the role of promoter polymorphisms in rheumatoid arthritis patients and healthy individuals // Genes and Immunity. - 2001. - Vol. 2. - P.135-144.
5. Skoog, T. A., van´t Hooft F., et al. Common functional polymorphism (C→A substitution at position -863) in the promoter region of the tumour necrosis factor-α (TNF-α) gene associated with reduced circulating levels of TNF-α // Hum Mol Genet. - 1999. - Vol.8. - P. 1443-1449.

Работа поддержана грантом Правительства Челябинской области 2007г. (008.04.05-07.БX)