В современной панкреатологии доминирует концепция, согласно которой многообразие патологических изменений в организме, возникающих при остром панкреатите, обусловлено высвобождением не только ферментов поджелудочной железы, но и целого ряда медиаторов из гуморальных и клеточных источников.
Инициирующим фактором острого панкреатита является поступление в ткань поджелудочной железы продуктов панкреолиза, которые помимо прямого гистотоксического эффекта, играют роль триггеров, вызывающих выделение целого комплекса биологически-активных веществ. Возникает порочный круг: гипоксическое нарушение тканевого метаболизма приводит к выбросу вазоактивных веществ, которые усугубляют сосудистые нарушения.
При прогрессировании острого панкреатита развиваются дистрофические изменения в поджелудочной железе, активное участие в которых принимают лизосомы. Лизосомы определяют динамику воспаления, являясь по образному выражению Фриммера "стартовыми площадками воспалительной реакции". Однако влияние биологически активных веществ на лизосомы поджелудочной железы до сих пор остаётся недостаточно изученной.
Целью нашего исследования было: изучить влияние медиаторов биологически активных веществ (гистамин, адреналин, ацетилхолин, липаза, трипсин, химопсин) на лизосомы поджелудочной железы.
Материалы и методы исследования: Опыты были поставлены на 28 собаках. За 15-20 минут до оперативного вмешательства животным проводили премедикацию калипсолом внутривенно из расчета 10 мг сухого вещества на 1 кг массы животного, затем внутрилегочно вводили раствор тиопентала натрия (30 мг на 1 кг массы тела). По достижении глубины наркоза, с соблюдением правил антисептики, верхнесрединной лапаротомией послойно вскрывали брюшную полость. В ткань поджелудочной железы вводили изотонический раствор хлорида натрия, а внутривенно исследуемые биологически активные вещества. После указанных выше манипуляций брюшную полость ушивали наглухо. Контролем служила группа из 4 собак, которым после оперативного вмешательства внутривенно вводили изотонический раствор хлорида натрия. Через час собак обеих групп умерщвляли. В гомогенатах поджелудочной железы исследовали активность кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2.) по De Duve с соав. (1955).
Лизосомы выделяли методом дифференцированного центрифугирования в 0,25 миллилитре сахарозы с 1 милимолем ЭДТА. Реакцию лизосомально-вакуолярного аппарата поджелудочной железы на внутривенное введение некоторых биологически активных веществ определяли по активности маркера лизосом - кислой фосфатазы. При этом определяли свободную, общую активность фермента, осмотическую устойчивость лизосом после инкубации в гипоосмотичной среде сахарозы (0,125 М).
Обсуждение полученных результатов: при введении в целостный организм собак адреналина, ацетилхолина, гистамина, трипсина, химопсина, липазы мы обнаружили, что эти биологически-активные вещества активизируют лизосомально-вакуолярный аппарат поджелудочной железы. Это проявляется в значительном приросте измеряемой общей (удельной) и свободной активности кислой фосфатазы, снижение осмотической устойчивости лизосом. По степени активации лизосом биологически-активные вещества располагаются в следующей последовательности: гистамин>адреналин >ацетилхолин >липаза > химопсин > трипсин.
Подобная ответная реакция лизосом поджелудочной железы на введение в целостный организм биологически-активных веществ свидетельствует об объемном изменении органелл, связанное с увеличением числа более крупных вторичных лизосом (гетеро- и аутофаголизосом), и переходе лизосомальных гидролаз из латентного состояния в активное. Последнее событие возможно только во вторичных лизосомах. При этом отмечаются скрытые признаки лабилизации лизосомальных мембран, обнаруженные по приросту свободной активности кислой фосфатазы после кратковременной инкубации гомогенатов поджелудочной железы в гипоосмотической среде сахарозы. По лабилизирующему действию на лизосомы исследуемые биологически-активные вещества распределились в следующей последовательности: трипсин > ацетилхолин > адреналин > гистамин > липаза > химопсин (таблица 1).
Таким образом, анализ полученных данных показал, что наряду с ферментами (липаза, химопсин, трипсин) в активизации и лабилизации лизосомальных мембран клеток поджелудочной железы при остром панкреатите принимают участие и другие биологически-активные вещества (гистамин, ацетилхолин, адреналин).
Для проверки последствий нарушений внутриорганного кровотока, обусловленного биологически активными веществами, в серии опытов было изучено действие биологически-активных веществ на лизосомы поджелудочной железы.
По существу для поджелудочной железы нами были созданы экстремальные условия, в которых энергетический гомеостаз начинает испытывать трудности, связанные с обеспечением его энергетическими субстратами. В этих условиях лизосомальный аппарат должен включаться в процесс обеспечения клеток поджелудочной железы энергетическим материалом.
Таблица 1. Действие медиаторов биологически активных веществ на активность кислой фосфатазы (мМоль Pi/мг белка за 1 мин.) поджелудочной железы собак (М m)
|
Исследуемое вещество |
Свободная |
Общая |
Осмотическая устойчивость лизосом |
|
1.изотонический раствор натрия хлорида (контрольная группа) |
0,061 0,006 |
3,391 0,026 |
0,033 0,004 |
|
2. липаза (1 мг на кг массы) |
0,864 0,051 р1-2 <0,001 |
3,426 0,049 р1-2 <0,1 |
0,182 0,005 р1-2 <0,001 |
|
3. химопсин (1 мг на кг массы) |
0,342 0,004 р1-3 <0,001 |
1,509 0,019 р1-3 <0,001 |
0,158 0,008 р1-3 <0,001 |
|
4. трипсин (1 мг на кг массы) |
0,120 0,004 р1-4 <0,05 |
1,124 0,022 р1-4 <0,001 |
0,894 0,038 р1-4 <0,001 |
|
5. ацетилхолин (1 мг на кг массы) |
0,863 0,017 р1-5 <0,001 |
3,594 0,016 р1-5 <0,05 |
0,470 0,006 р1-5 <0,001 |
|
6. адреналин (1 мг на кг массы) |
0,891 0,008 р1-6 <0,001 |
3,568 0,015 р1-6 <0,01 |
0,346 0,002 р1-6<0,001 |
|
7. гистамин (1 мг на кг массы)
|
2,472 0,009 р1-7 <0,001 |
26,642 0,077 р1-7 <0,001 |
0,240 0,01 р1-7 <0,05 |
При введении в целостный организм адреналина, ацетилхолина, гистамина, трипсина, химопсина, липазы мы обнаружили, что эти биологически-активные вещества активизируют лизосомально-вакуолярный аппарат поджелудочной железы. Это проявляется в значительном приросте измеряемой общей (удельной) и свободной активности кислой фосфатазы, снижение осмотической устойчивости лизосом.
Подобная ответная реакция лизосом поджелудочной железы на введение в целостный организм биологически-активных веществ свидетельствует об объемном изменении органелл, связанное с увеличением числа более крупных вторичных лизосом (гетеро- и аутофаголизосом), и переходе лизосомальных гидролаз из латентного состояния в активное. Последнее событие возможно только во вторичных лизосомах. При этом отмечаются скрытые признаки лабилизации лизосомальных мембран, обнаруженные по приросту свободной активности кислой фосфатазы после кратковременной инкубации гомогенатов поджелудочной железы в гипоосмотической среде сахарозы.
Мессенджером, определяющим передачу эффекта биологически-активных веществ в клетку, является цАМФ. Последствием увеличения концентрации цАМФ в клетке будет стабилизация мембран лизосом посредством фосфорилирования их структурных компонентов цАМФ - зависимыми протеиназами. Наблюдаемый в наших опытах противоположный эффект, очевидно, обусловлен активацией гуанилатциклазы, относительным уменьшением цАМФ в цитоплазме клеток и лабилизацией лизосом.
По мнению ряда авторов, внутриклеточный уровень цАМФ, цГМФ зависит от активности фосфодиэстераз, превращающих циклические нуклеотиды в нециклические. Синтез циклических нуклеотидов так же зависит от внутриклеточного соотношения АТФ и ГТФ. Нарушение микроциркуляции в поджелудочной железе при остром панкреатите сопровождается снижением поступления в клетку молекулярного кислорода и глюкозы, концентрация АТФ значительно уменьшается и формируется ацидоз.
Основными причинами ацидоза при О2 дефиците является образование ионов Н+ в результате гликолиза: глюкоза 2 лактат + 2Н+, снижение утилизации ионов Н+ вследствие уменьшения синтеза АТФ. Умеренный ацидоз
(рН=6,2-5,8) уменьшает активность катехоламин-стимулированнной аденилатциклазы и образование цАМФ, угнетается активность фосфолипаз.
При блокирование аэробного процесса энергообразования, расходование внутриклеточного АТФ достигает 86,9 %. Образующиеся продукты имеют более кислый характер, чем исходные. Резко возрастает активность гуанилатциклазы, уменьшается содержание цАМФ, увеличивается лабилизация лизосомальных мембран и солабилизации ферментов. Следовательно, отрицательное смещение энергетического баланса клеток поджелудочной железы является метаболической основой развития панкреатита и в последующем панкреонекроза.
Необходимо отметить, что наиболее выраженный повреждающий эффект на лизосомы поджелудочной железы отмечен у гистамина. Это подтверждает предположение об его участии в повреждении поджелудочной железы при остром панкреатите. Высвобождение гистамина одна из первых реакций тканей на повреждение. Эффекты этого медиатора проявляются уже через несколько секунд после действия повреждающего агента, в результате чего (после почти мгновенной вазоконстрикции) быстро развивается вазодилятация и появляется первая волна увеличения проницаемости сосудов, миграция лейкоцитов, увеличение проницаемости мембран лизосом в поджелудочной железе при остром панкреатите.
Повышение симпато-адреналовых влияний на клетки поджелудочной железы увеличивают активность интрацеллюлярных липаз, способствуют накоплению жирных кислот и тем самым увеличивают интенсивность ПОЛ. При значительной активации ПОЛ, когда окислительной трансформации подвергается значительная часть липидов и фосфолипидов, физико-химическая и ультраструктурная организация мембран лизосом нарушается, происходит дестабилизация мембран лизосом и выход из них гидролитических ферментов. Всё это в итоге приводит к аутолизу субклеточных структур клеток поджелудочной железы.
Наблюдаемое в наших опытах повышение активности лизосомально-вакуолярного аппарата под действием ацетилхолина осуществляется путем его связывания с рецепторами на мембране клеток поджелудочной железы, увеличением активности гуанилатциклазы и повышением внутриклеточного цГМФ. В дальнейшем происходит стимуляция лизосом через систему микротрубочек и увеличение количества вторичных лизосом аутофагического типа и лабилизация мембран лизосом.
Изучая последствия взаимодействия ферментов поджелудочной железы с ее лизосомами, мы обратили внимание, что по лабилизирующему действию на лизосомы на первом месте стоит трипсин, затем липаза и химотрипсин. Трипсин и химотрипсин осуществляют каталитическое расщепление пептидов избирательным образом. Трипсин гидрализует только те пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы лизина и аргинина. Химопсин (аморфный химотрипсин), содержащий смесь α- химотрипсина и трипсина, от трипсина отличается тем, что расщепляются преимущественно связи, образованные остатками ароматических аминокислот (тирозин, триптофан, фенилаланин, метионин). Химопсин активируется в щелочной среде кишечника под влиянием трипсина, который гидролизует четыре пептидные связи и удаляет из молекулы химотрипсиногена два дипептида. В результате образуется активный химотрипсин. Низкая протеолитическая активность химопсина, в наших опытах, очевидно, обусловлена отсутствием в этот момент активного трипсина и высоких значений pH.
Существующие в литературе мнения о трипсине как основном "триггере" острого панкреатита не подтвердились нашими исследованиями. При его введении в целостный организм обнаружено наименьшее увеличение свободной и общей активности кислой фосфатазы.
Таким образом, при введении в целостный организм адреналина, ацетилхолина, гистамина, трипсина, химопсина, липазы мы обнаружили, что эти биологически-активные вещества активизируют лизосомально-вакуолярный аппарат поджелудочной железы. Это проявляется в значительном приросте измеряемой общей (удельной) и свободной активности кислой фосфатазы, снижение осмотической устойчивости лизосом.