Введение
Тест «Открытое поле» был впервые предложен К. Холлом в 30-е годы пошлого столетия [1] для изучения роли новизны в возникновении тревоги. Этот тест позволяет исследовать ориентировочную реакцию и эмоциональную реактивность грызунов в новых условиях среды, а так же дает возможность прогнозировать реакцию животных на действие различных стрессоров [2,3]. На основании этого «Открытое поле» используют для разделения грызунов на группы в зависимости от индивидуально-типологических характеристик. Показано, что исследуемые показатели коррелируют с результатами других поведенческих тестов [4].
Вместе с этим, в современных работах, посвященных изучению психотропного эффекта различных по своей природе факторов [5,6], тест «Открытое поле» используют в качестве модели тревоги. При этом особо подчеркивают стрессогенное воздействие условий тестирования [7]. В связи с тем, что воспроизводимость результатов исследований, посвященных изучению стресса, зависит от напряжения систем, обеспечивающих адаптацию у животных, вводимых в эксперимент, возникает необходимость исследовать реакцию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (ГГНС) и симпато-адреналовой систем (САС) на помещение животных в камеру «Открытого поля».
Целью данной работы было проанализировать динамику показателей гормонально-медиаторного обмена, содержания гликогена и перекисного окисления липидов в печени у крыс, находящихся в течение часа в камере, предназначенной для проведения теста «Открытое поле».
Материалы и методы
Работа выполнена на 60 белых беспородных крысах обоего пола массой 115-150 г. Все экспериментальные процедуры проводились согласно международным правилам по содержанию и работе с лабораторными животными [8]. Экспериментальное воздействие заключалось в помещении крыс в «Открытое поле» на 3, 30 и 60 минут. Крысы, не подвергающиеся экспериментальному воздействию, служили контролем. Таким образом, все животные были поделены на четыре группы, рандомизированные методом парных аналогов по массе и полу.
«Открытое поле» представляло собой камеру 1 м в длину и 1 м в ширину, с высотой стенок 0,5 м, из белого пластика, дно которой было расчерчено на 25 равных квадратов. Освещение производилось лампой мощностью 100 Вт, подвешенной на высоте 1,5 м от дна камеры. Перед проведением теста животных держали в течение 3 минут в затемненном картонном пенале размером 300 х 150 х100 мм с отверстиями для доступа воздуха.
Животных выводили из эксперимента путем декапитации не позднее чем через 1 минуту после истечения сроков воздействия. Плазму на анализ брали с 5% раствором ЭДТА. Головной мозг извлекали, отделяли от спинного мозга на уровне выхода первой пары шейных нервов и гомогенизировали с 10% раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Надпочечники взвешивали, относительную массу желез выражали в процентах от массы тела крысы. Готовили гомогенаты левого надпочечника в 30% спирте и правого надпочечника в 10% раствора ТХУ. Для определения концентрации 11-оксикортико-стероидов (11-ОКС) печень гомогенизировали в 30% растворе спирта. Для анализа продуктов перекисного окисления готовили гомогенаты печени в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,6.
Содержание гистамина и серотонина в мозге определяли по методу [9], адреналинина, и норадреналина по [10]. Результаты анализа пересчитывали на массу мозга. Уровень 11-ОКС в левом надпочечнике, плазме крови и печени определяли по методу [11]. Содержание адреналина в гомогенатах правых надпочечников определяли по методу [10]. Уровень аскорбиновой кислоты и ее дериватов определяли в гомогенатах правого надпочечника по методу [12] и пересчитывали на массу железы. Содержание малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов в гомогенатах печени определяли по методу [13] и [14], соответственно.
Для проверки однородности дисперсий в группах применяли критерии Ливена. Результаты исследований представляли в виде среднего плюс/минус стандартная ошибка среднего. Различие средних значений в группах сравнивали с помощью стандартного t-критерия Стьюдента, с учетом поправки Бонферрони [15]. Отличия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты
Проведенные исследования выявили изменения в функционировании медиаторных систем мозга у крыс, находящихся в камере теста «Открытое поле». При помещении животных в экспериментальную камеру у них обнаружилось повышение содержания серотонина, снижение уровня гистамина и норадреналина в мозге (табл.1). Изменения концентрации адреналина не наблюдалось.
Наряду с биохимическими сдвигами в медиаторных системах мозга крыс, пребывание животных в «Открытом поле» приводило к изменению показателей, характеризующих функциональную активность надпочечников.
Таблица 1.
Изменение уровня моноаминов в мозге крыс в «Открытом поле»
|
Показатель |
Время нахождения в экспериментальной камере, мин |
|||
|
0 |
3 |
30 |
60 |
|
|
Уровень гистамина в мозге, мкг/мг |
4,75±0,37 |
4,58±0,35 |
4,11±0,40 |
2,92±0,29a,b |
|
Уровень серотонина в мозге, мкг/мг |
1,27±0,13 |
1,29±0,14 |
2,17±0,16a,b |
2,05±0,23a,b |
|
Уровень адреналина в мозге, мкмоль/мг |
0,37±0,02 |
0,34±0,03 |
0,38±0,03 |
0,41±0,03 |
|
Уровень норадреналина в мозге, мкмоль/мг |
1,18±0,06 |
0,89±0,05a |
0,82±0,06a |
0,91±0,06a |
a-отличие от группы крыс, не пребывавших в «Открытом поле», статистически значимо (p<0,05)
b- отличие от группы крыс, пребывавших 3 минуты в «Открытом поле», статистически значимо (p<0,05)
Через 3 минуты нахождения животного в камере у них повышался уровень 11-ОКС в крови и печени, что свидетельствовало об активизации ГГНС, хотя увеличения массы надпочечников и изменения содержания глюкокортикоидов в них не происходило (табл. 2).
Таблица 2.
Функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и уровень адреналина в надпочечниках крыс в «Открытом поле»
|
Показатель |
Время нахождения в экспериментальной камере, мин |
|||
|
0 |
3 |
30 |
60 |
|
|
Относительная масса НП, % |
0,019 ±0,002 |
0,023 ±0,001 |
0,022 ±0,002 |
0,020 ±0,002 |
|
11-ОКС в надпочечниках, мкг/мг |
0,26 ±0,03 |
0,29 ±0,04 |
0,33 ±0,05 |
0,35 ±0,05 |
|
11-ОКС в плазме, мкг/мл |
0,018 ±0,002 |
0,039 ±0,004a |
0,028 ±0,002b |
0,026 ±0,003b |
|
11-ОКС в печени, мкг/мг |
0,016 ±0,002 |
0,028 ±0,004a |
0,024 ±0,003 |
0,020 ±0,002 |
|
Аскорбиновая кислота в надпочечниках, мкг/г |
106,91 ±9,90 |
63,56 ±3,73a |
104,10 ±17,41 |
96,88 ±10,07 |
|
Дериваты аскорбиновой кислоты в надпочечниках, мг/г |
1,92 ±0,13 |
1,93 ±0,14 |
1,81 ±0,18 |
2,17 ±0,16 |
|
Адреналина в надпочечниках, мкмоль/г |
2,27 ±0,23 |
1,46 ±0,15a |
1,58 ±0,21 |
1,51 ±0,11a |
a-отличие от группы крыс, не пребывавших в «Открытом поле», статистически значимо (p<0,05)
b- отличие от группы крыс, пребывавших 3 минуты в «Открытом поле», статистически значимо (p<0,05)
Выброс глюкокортикоидов в кровь сопровождался снижением уровня аскорбиновой кислоты в надпочечниках. При этом уровень метаболитов аскорбиновой кислоты: дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в железах крыс не изменялся. Кроме того, на помещение в «Открытое поле» крысы реагировали снижением уровня адреналина в надпочечниках. Аналогичное снижение наблюдалось и через час пребывания крыс в экспериментальной камере.
Изменение в печени уровня МДА при тестировании крыс в «Открытом поле» происходило волнообразно. В течение первых трех минут нахождения животного в камере наблюдалось увеличение уровня МДА, через 30 минут величина исследуемого показателя возвращалась к норме, а через 60 минут снова возрастала (табл.3). Кроме того, 30 минутное пребывание крысы в «Открытом поле» приводило к возрастанию уровня диеновых кетонов и диеновых конъюгатов, субстратом которых был холестерол и триацилглицерол (ТАГ).
Изменения уровня диеновых кетонов и конъюгатов, субстратом которых были фосфолипиды, в печени крыс, находящихся в «Открытом поле» не происходило. Помещение крыс в камеру на 60 минут приводило к снижению гликогена печени.
Обсуждение
Тест «Открытое поле» используется для изучения ориентировочно-исследовательского поведения и эмоциональной реактивности грызунов при попадании в новые условия окружающей среды. Помещение животного в камеру «Открытого поля» запускает паттерны исследовательского поведения, реализации которых препятствуют условия, вызывающие страх [16]. Поэтому «Открытое поле» применяют в качестве экспериментальной модели тревоги при лабораторных исследованиях [7].
Можно считать, что реакция животных на помещение в камеру «Открытого поля» обусловлена исключительно эмоциональным фактором, так как в экспериментальных условиях исключены факторы, приводящие к развитию системного стресса. Биохимические сдвиги в функционировании медиаторных систем мозга, обнаруживающиеся при помещении крыс в «Открытое поле», вероятно, обусловлены активацией и торможением структур, связанных с реакцией на стрессовые условия среды. Такими образованиями в мозге являются ретикулярная формация, голубое пятно и лимбическая система [17]. Возможно, состояние стресса, испытываемое животным в условиях «Открытого поля», усиливает афферентацию от миндалины и передней части коры больших полушарий к гипоталамусу, приводя к выбросу глюкокортикоидов в кровь посредством повышения активности ГГНС в целом. Усиленная секреция коры надпочечников сопровождается синтезом глюкокортикоидов, о чем свидетельствует снижение уровня аскорбиновой кислоты в этих железах.
Таблица 3.
Изменение показателей перекисного окисления липидов и содержания гликогена в печени крыс в «Открытом поле»
|
Показатель |
Время нахождения в экспериментальной камере, мин |
|||
|
0 |
3 |
30 |
60 |
|
|
Малоновый диальдегид, нмоль/г |
28,43 ±1,54 |
35,95 ±1,38a |
27,98 ±1,65b |
37,29 ±2,75a,c |
|
Диеновые кетоны субстрат холестерин и ТАГ в печени, нмоль/г |
0,0101 ±0,0007 |
0,0104 ±0,0007 |
0,0141 ±0,0007a,b |
0,0092 ±0,0009c |
|
Диеновых кетоны субстрат фосфолипиды в печени, нмоль/г |
0,158 ±0,006 |
0,156 ±0,006 |
0,161 ±0,006 |
0,147 ±0,005 |
|
Диеновые конъюгаты субстрат холестерин и ТАГ в печени, нмоль/г |
0,059 ±0,002 |
0,063 ±0,002 |
0,072 ±0,004a |
0,065 ±0,003 |
|
Диеновые конъюгаты субстрат фосфолипиды в печени, нмоль/г |
0,180 ±0,005 |
0,177 ±0,004 |
0,183 ±0,005 |
0,176 ±0,004 |
|
Гликоген в печени, мг/г |
40,50 ±5,61 |
33,46 ±2,71 |
34,75 ±2,09 |
22,70 ±1,99a,b,c |
a - отличие от группы крыс, не пребывавших в «Открытом поле», статистически значимо (p<0,05)
b - отличие от группы крыс, пребывавших 3 минуты в «Открытом поле», статистически значимо (p<0,05)
c - отличие от группы крыс, пребывавших 30 минут в «Открытом поле», статистически значимо (p<0,05)
Кроме того, в реакцию крыс на помещение в «Открытое поле» включается САС, что сопровождалось выбросом адреналина в кровь и снижением его уровня в мозговом веществе надпочечников. Вместе с этим адреналин вызывает мобилизацию гликогена, снижая его содержание в печени через 60 минут пребывания крыс в камере.
Активизация процессов перекисного окисления липидов при стрессе происходит в ранние сроки действия стрессора (фазу тревоги) за счет нарушения редокс-равновесия и охватывает весь организм [18]. В нашей работе динамика изменения уровня продуктов ПОЛ в печени характеризовалась периодическими спадами и подъемами. Так уровень МДА в печени возрастал через 3 и 60 минут пребывания крысы в «Открытом поле», а при 30 минутном воздействии не отличался от контроля. Снижение содержания МДА до уровня контроля сопровождалось повышением концентрации диеновых кетонов и конъюгатов, субстратом которых был холестерол и ТАГ. При этом через час, после помещения животных в экспериментальную камеру, наблюдалось снижение содержания данных показателей и повышение уровня МДА в печени. Такая сложная динамика изменения продуктов ПОЛ, вероятно, обусловлена особенностью протекания процессов свободно-радикального окисления, а не активацией антиоксидантной системы. Так как в последнем случае наблюдалось бы снижение уровня всех продуктов ПОЛ. Содержание диеновых конъюгатов и кетонов, субстратом которых были фосфолипиды, при помещении крыс в «Открытое поле», остается постоянным.
Заключение
Реакция организма крыс на помещение в «Открытое поле» обнаруживалась уже через 3 минуты пребывания в камере. Экспериментальное воздействие изменяло активность гистамин-, серотонин- и норадренэргических систем головного мозга, активировало ГГНС и САС, оказывая стрессирующий эффект. Пребывание животных в «Открытом поле» снижало уровень гликогена и активизировало процессы ПОЛ в печени.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
- Hall C.S. // J.Comp. Psychol, 1934. V.22. P.345-352.
- Коплик Е.В., Салиава Р.М., Горбунова А.В. // Журнал высшей нервной деятельности, 1995. Т.45. №4. С. 775-781.
- Подковкин В.Г. Иванов Д.Г. // Успехи современного естествознания, 2008. №11.
С. 5-17. - Мельников А.В., Куликов М.А., Навикова М.Р., Шарова Е.В. // Журнал Высшей нервной деятельности им. Павлова, 2004. №5. С. 712-717.
- Спасов А.А., Иежица И.Н., Харитонова М.В., Кравченко М.С. // Журнал Высшей нервной деятельности им. Павлова, 2008. №4. С. 476-485.
- Дыгало Н.Н., Шишкина Г.Т. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 1999. №1. С.105-109.
- Калуев А.В. // Нейронауки, 2006. №1. С.34-56.
- European Communities Council Directives of 24 November1986, 86/609/EEC
- Подковкин В.Г. Определение концентрации гистамина и серотонина в биологическом материале с помощью флуоресцентного анализа / Деп. в ВИНИТИ 12.07.1995 №2136-В 95 -7с.
- Подковкин В.Г. Микрометод определения катехоламинов в крови и тканях мелких лабораторных животных / Деп. в ВИНИТИ 4.7.1988 №5349-В 88 - 4с.
- Подковкин В.Г. Микромодификация метода определения 11-оксикортикостероидов / Деп. в ВИНИТИ 4.7.1988 №5348-В 88 - 4с.
- Соколовский В.В., Лебедева Л.В., Лиэлуп Т.Б // Лабораторное дело, 1974. №3. С.160 -162.
- Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. // Современные методы биохимии. М.:Медицина, 1977. С.66-68.
- Костюк В.А. // Украинский биохимический журнал, 1991. №1. С.98-101.
- Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1998. - 459с.
- Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Наука, 1992. - 250 с.
- Симонов П.В. // Журнал высшей нервной деятельности, 1993. №3. С. 514-529.
- Барабой В.А. Биоантиоксиданты. Киев: Книга плюс, 2006. - 461с.