Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

Среди бактериальных инфекций наиболее опасной является чума, оставившая глубокий след в истории человечества. Три ее пандемии унесли жизни около 200 млн. человек. В прошлом эпидемии чумы нередко приводили к падению государств и разрушению древних цивилизаций. В отдельных странах погибало до 9/10 населения. И в настоящее время данная инфекция постоянно остается в поле зрения органов здравоохранения. Существование на территориях нашей страны и многих государств мира очагов чумы, где возбудитель циркулирует среди грызунов, обуславливает потенциальную угрозу эпидемических осложнений. Использование современных транспортных средств может способствовать заносу инфекции на расстояния, в том числе и в районы, где нет достаточной настороженности медицинской службы в отношении этого заболевания. Кроме того, войны и другие социальные и экологические катастрофы по-прежнему могут угрожать взрывами чумных эпидемий.

Чума - острое инфекционное заболевание, относящееся к группе особо опасных карантинных болезней. Носителями возбудителя чумы в природе являются различные виды грызунов, а переносчиками - их блохи. До настоящего времени многие миллионы квадратных километров суши продолжают оставаться местом обитания более 200 видов грызунов, которые заражаются чумой в природе, не считая синантропных крыс и мышей. Поэтому чума, по классификации Е.Н. Павловского, отнесена к природно-очаговым трансмиссивным болезням. Главный механизм существования чумы в природе - эпизоотический процесс. Эпизоотия чумы - это множественные последовательные заражения животных друг от друга, при которых передача возбудителя просходит по схеме : грызун - блоха - грызун. Согласно классификации бактерий, используемой в определителе Берги, чумной микроб (Y.pestis) относят к роду Yersiniae семейства Enterobacteriaceae.

В нашей работе мы использовали следующие факторы патогенности чумного микроба: чумной аутолизат, состоящий из около 30 различных субстанций, в частности липополисахарид, «мышиный» токсин, коагулазу, фибринолизин, гемолизин и другие, а также фракции F2.

«Мышиный» токсин, или фракция F2, по Бейкеру (1952), - белок, состоящий из двух компонентов А и В с молекулярной массой 240 и 120 КД, имеющих примерно одинаковую токсичность для мышей. Каждый из компонентов состоит из нескольких субъединиц, построенных из двух полипетидных цепей. Субъединицы с молекулярной массой до 12000 Д сохраняют биологическую активность, присущую полноценной молекуле. LD50 фракции F2 для белых мышей составляет 0.7-6.0 мкг/кг. Летальные дозы для морских свинок - в сотни раз выше. Предполагается, что молекулярный механизм действия «мышиного» токсина заключается в его способности подавлять экзогенное дыхание, действуя на систему транспорта электронов. Другие авторы связывают поражающее действие фракции F2 со способностью к блокаде b-адренорецепторов. Показано, что «мышиный» токсин оказывает цитотоксическое действие на культуру макрофагов морской свинки, угнетает переваривающую способность перитонеальных макрофагов, не влияя на их поглотительную активность. В тоже время «мышиный» токсин не вызывает видимых морфологических изменений в монослое культур перевиваемых клеток различного происхождения. Иммунизация чувствительных животных очищенным препаратом «мышиного» токсина стимулирует у них выработку антитоксинов, нейтрализующих токсин, но не повышает резистентности к инфекции, хотя несколько и продлевает жизнь зараженных животных. «Мышиный» токсин кодируется плазмидой pFra (60 MD).

Потеря чумным микробом способности вырабатывать «мышиный» токсин не сопровождается снижением вирулентности для мышей и морских свинок, поэтому мы также использовали чумной аутолизат, в состав которого вошли около 30 различных субстанций, в частности:

Липополисахарид, или R-гликолипид, имеет очень ограниченный состав моносахаридов. Липополисахариду принадлежит ведущая роль в патогенезе чумы. При этом установлено, что липополисахарид чумного микроба универсально токсичен для лабораторных животных - мышей, крыс, морских свинок, кроликов, обезьян. Летальная токсичность препаратов липополисахарида чумного микроба достаточна высока. Их LD50 для мышей при внутрибрюшинном введении варьирует в пределах 0.18-3.0 мг.

Фибринолизин. Фибринолитическая активность является одним из наиболее постоянных свойств чумного микроба, присущих как высоко- , так и слабовирулентным штаммам. Предполагается, что фибринолизин чумного микроба является активатором плазминогена. Условия, благоприятствующие проявлению фибринолизина, создаются при коагуляции фибриногена плазмокоагулазой Y.pestis. Последнее объясняется тем, что при связывании фибриногена происходит концентрирование соответствующего фибринолитического агента в сгустке фибрина, приводящее к его изоляции от ингибиторов. Если учесть, что в очагах воспаления при чуме почти всегда скапливается большое количество микробов, являющихся активаторами плазминогена, то коагуляцию следует расценивать как фактор, способствующий разрушению фибринового барьера и облегчающий дальнейшее распространение бактерий. С другой стороны, наличие у чумного микроба способности к коагуляции плазмы может явиться фактором, который в какой-то мере также предохраняет бактерии от фагоцитоза. Ген, кодирующий синтез фибринолизина, расположен на плазмиде 6.3 МД (pPst).

Факторы патогенности чумного микроба приводят к ишемии в тканях, гипоксии и, как следствие, изменение активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

ПОЛ протекает в клетках и норме. Оно является небходимым звеном таких жизненно важных процессов, как транспорт электронов в цепи дыхательных ферментов, синтез простогландинов и лейкотриенов, пролиферация и дифференцировка клеток, фагоцитоз, метаболизм катехоламинов и др. ПОЛ участвует в процессах регуляции липидного состава биомембран и, как следствие, активности мембраносвязанных ферментов. Интенсивность ПОЛ регулируется соотношением факторов активирующих (прооксиданты) и подавляющих этот процесс (антиоксиданты - (АО)). В норме 1-2% от потребляемого кислорода.

К числу наиболее активных прооксидантов относятся легко самоокисляющиеся соединения, индуцирующие образование свободных радикалов (нафтохиноны, витамины A , D); восстановители (НАДФН, НАДН, липоевая кислота, низкие концентрации аскорбиновой кислоты); соединения, образующиеся в процессе обмена веществ - свободнорадикальные продукты различного происхождения (эндоперекиси простогландинов, продукты метаболизма лейкотриенов, адреналина).

Выраженный АО-эффект оказывают вещества токоферольного ряда (a-токоферол, тироксин, стероидные гормоны); убихиноны; селен и его соединения (главным образом глутатионпероксидазы); супероксиддисмутаза; вещества, содержащие тиоловую группу; анионы, связывающие железо.

В реакции пероксидации могут вовлекаться соединения различного биохимического состава. Однако ведущее значение среди них имеет ПОЛ. Это определяется тем, что они в большей мере обеспечивают структурную и функциональную основу жизнедеятельности клеток, а также легко вступают в оксидазные реакции.

Процесс ПОЛ можно разделить на несколько этапов:

1). Формирование активных форм кислорода, прежде всего гидроксильного радикала, обладающего максимальной реактогенностью, под влиянием различных инициирующих факторов инфекционной и неинфекционной природы.

2). Извлечение водорода из боковых цепей ненасыщенных жирных кислот с образованием углеродосодержащего радикала и воды.

3). Взаимодействие углеродосодержащего радикала с молекулярным кислородом с образованием перекисного радикала.

4). Извлечение водорода из боковой цепи ненасыщенных жирных кислот пероксидным радикалом с образованием липидной гидроперекиси и еще одного углеродного радикала.

5). Липидные гидроперекиси увеличивают концентрацию цитотоксических альдегидов, а углеродсодержащий радикал поддерживает реакцию формирования пероксидных радикалов по цепочке.

Изменение состава и вязкости липидов мембраны в результате протекания ПОЛ существенно влияет на активность мембраносвязанных ферментов, регулирующих процессы энергообеспечения клеток, транспорт катионов, синтез нуклеиновых кислот, чувствительность к нейроэффекторным и гуморальным управляющим влияниям. Таким образом, в норме изменение интенсивности ПОЛ и активности антиоксидантных систем в значительной мере модифицирует состав и структуру липидной фазы мембран, их липопротеидных комплексов, а также мембраносвязанных ферментов. В соответствии с этим меняется в конечном счете и характер ответа клеток на различные воздействия.

Чрезмерная интенсификация ПОЛ обуславливает повреждение белковых и липидных компонентов мембран, а также мембраносвязывающих и свободных ферментов клеток.

ЦЕЛЬ: Сравнительная оценка изменений активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), возникающих при воздействии комплекса разнообразных токсических и ферментных факторов патогенности чумного микроба (чумной аутолизат), а также при действии отдельной фракции F2 («мышиный» токсин), полученный из вакцинного штамма ЕВ Y.pestis.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ: Исследования проведены на беспородных белых крысах обоего пола массой 150-180 грамм. Экспериментальное моделирование патологии достигалось внутрибрюшинным введением подопытным животным препаратов в дозе, эквивалентной ЛД50. Препараты вакцинного штамма ЕВ Y.рestis приготовлены РосНИИПЧИ «Микроб». Исследования комплексного воздействия токсических и ферментных факторов патогенности проводились с использованием чумного аутолизата, приготовленного из живой чумной вакцины штамма ЕВ методом механической дезинтеграции микробных клеток и последующего извлечения внутриклеточных фракций. Аутолизат содержит около 30 различных субстанций, в частности липополисахарид (ЛПС), «мышиный» токсин, коагулазу, фибринолизин, гемолизин и другие. Сравнительные серии экспериментов проведены с использованием отдельных факторов вакцинного штамма ЕВ чумного микроба: фракции F2 - «мышиного» токсина, полученного методом Беккера. Изучено содержание продуктов липопероксидации - гидроперекисей липидов (ГПЛ) и малонового диальдегида (МДА) в плазме крови и эритроцитах экспериментальных животных с использованием общепринятых спектрофотометрических методов исследования спустя 1,5-2; 4 и 10-24 часа после внутрибрюшинного введения указанных препаратов белым крысам.

РЕЗУЛЬТАТЫ: В экспериментах, проведенных спустя 1,5-2 часа после введения чумного аутолизата белым крысам, то есть в доклинический период интоксикации, было обнаружено значительное повышение уровней ГПЛ и МДА в плазме крови и эритроцитах.

На среднетяжелой стадии, спустя 4 часа, количество МДА и ГПЛ в плазме крови и эритроцитах оставалось достоверно высоким. В плазме крови происходило дальнейшее прогрессирующее накопление МДА.

В период тяжелых клинических проявлений интоксикации - спустя 24 часа после введения аутолизата - отмечалось прогрессирующее накопление ГПЛ и МДА и в плазме крови, и в эритроцитарной массе.

Таблица 1. Изменения уровней ГПЛ и МДА в плазме крови и эритроцитах при отравлении мышей чумным аутолизатом

Как оказалось, в экспериментах с использованием фракции «мышиного» токсина вакцинного штамма ЕВ чумного микроба, спустя 1,5-2 часа, то есть на фоне отсутствия клинических признаков патологии, возникало накопление ГПЛ и МДА в плазме крови и эритроцитах экспериментальных животных.

В последующих сериях экспериментов спустя 4 часа на фоне клинических проявлений средней степени отмечалось дальнейшее прогрессирующее накопление продуктов липопероксидации как в плазме крови, так и в эритроцитах.

В последующих сериях экспериментов спустя 24 часа на фоне бурных клинических проявлений тяжелой степени отмечалось дальнейшее прогрессирующее накопление продуктов липопероксидации как в плазме крови, так и в эритроцитах.

Таблица 2. Изменения уровней ГПЛ и МДА в плазме крови и эритроцитах при отравлении мышей фракцией F2

ВЫВОДЫ: Полученные данные убедительно свидетельствуют о том, что активация процессов ПОЛ представляет собой типовое нарушение метаболических процессов при воздействии токсических и ферментных факторов патогенности вакцинного штамма ЕВ Y.pestis, так как возникает как при сочетанном воздействии, достигаемом введением чумного аутолизата, так и при введении фракции F2 исследуемого вакцинного штамма. Значительные нарушения активности процессов липопероксидации в условиях воздействия препарата F2 вакцинного штамма ЕВ подтверждают возможность индукции «мышиным» токсином системных метаболических расстройств в условиях чумной инфекции и интоксикации. Сравнительная оценка эффектов фракции F2 и чумного аутолизата, позволила выявить более выраженную активацию процессов ПОЛ при действии чумного аутолизата, то есть при сочетанном воздействии токсических и ферментативных факторов чумного микроба, что свидетельствует о возможности взаимопотенциирования эффектов факторов патогенности Y.pestis.

Работа представлена на конференцию студентов и молодых ученых «Международный форум молодых ученых и студентов», г. Анталия, Турция, 17-24 августа 2004 г.