Целью настоящего исследования было сравнение уровня чувствительности к полимиксину В штаммов чумного микроба с известной структурой липоолигосахаридов (Knirel et al., 2003), а также изучение взаимодействия данного катионного пептида с живыми клетками Yersinia pestis, выращенными в различных условиях, и с выделенными из них препаратами ЛОС.
Культуры чумного микроба выращивали на чашках со средой Хоттингера или в L-бульоне при температуре 25 С или 37 С. Препараты ЛОС выделяли методом C. Galanos et al. (1969). Устойчивость к полимиксину определяли методом серийных разведений в L-бульоне в 96-луночных планшетах Cellstar. Наличие роста фиксировали по увеличению оптической плотности (OD = 595 нм) на приборе Multiskan (Labsystems). Определение уровня сорбции полимиксина В живыми клетками и препаратами ЛОС, а также изучение влияния полимиксина В на проницаемость клеток для лизоцима проводили, как описано в работе M. Skurnik et al. (1999).
По уровню чувствительности к полимиксину В изученные штаммы Y. pestis подразделяются на две группы: устойчивые - минимальная подавляющая концентрация (МПК) полимиксина В > 200 мкг/мл (KM260(11), 358/12, Tjiwidej, KM218, KIMD1, Colombo, K1(780), ЕV НИИЭГ) и чувствительные -
МПК полимиксина В 6-50 мкг/мл - (EV11M, 1146,17/18, 261ЖВР, 262ЖВР). Показано, что при выращивании клеток при температуре 25 С устойчивость выше, чем при выращивании при температуре 37 С. Например, для штамма Y. pestis KIMD1 МПК полимиксина В в этих условиях составляла 12500 мкг/мл и 390 мкг/мл соответственно. Интересно, что сорбция полимиксина В живыми клетками отмечена как для чувствительных, так и для устойчивых штаммов. Однако количество сорбированного антибиотика было несколько выше для клеток чувствительных штаммов Y. pestis (1,8 мкг/103 к.о.е. при температуре 25 С и 1,98 мкг/103 при 37 С), чем для устойчивых (1,6 мкг/103 к.о.е. при температуре 25 С и 1,8 мкг/103 при 37 С). Аналогичная картина наблюдалась при изучении влияния полимиксина В на проницаемость клеток чумного микроба для лизоцима. За 1 ч инкубирования в растворе полимиксина В с лизоцимом при температуре 37 С клетки чувствительных штаммов Y. pestis лизировались на 50 %, а устойчивых - на 5 %. Сорбция полимиксина В очищенными ЛОС в большей степени характерна для препаратов, выделенных из чувствительных штаммов и выращенных при температуре 25 С.
Принято считать, что устойчивость к полимиксину В определяется присоединением арабинозы к фосфатным остаткам в составе липида А. Однако во всех изученных штаммах независимо от их чувствительности к полимиксину В преобладали популяции молекул ЛОС, к обоим фосфатным остаткам которых были присоединены арабинозные остатки. Содержание арабинозы находилось в обратной корреляции со способностью препаратов ЛОС, но не клеток, из которых они были выделены, связывать полимиксин В. Во всех устойчивых к полимиксину В штаммах выявлены популяции молекул ЛОС, в составе внутреннего отдела кора которых присутствовали четыре остатка гептозы. В чувствительных штаммах такие популяции молекул ЛОС отсутствовали.
Скрининг представительного набора природных изолятов Y. pestis, относящихся ко всем подвидам возбудителя чумы, подтвердил данные И.Л. Мартиневского и И.С. Аракеляна (1981) о том, что чувствительность к бактерицидному действию полимиксина В характерна для представителей подвидов caucasica и hissarica. Впервые показано, что свежие изоляты подвида altaica также чувствительны к действию полимиксина В, но утрачивают эту способность в процессе хранения. Возможно, что избирательная вирулентность штаммов Y. pestis подвидов altaica, caucasica и hissarica в значительной степени определяется их чувствительностью к антимикробным катионным пептидам, являющимся составным элементом системы врожденного иммунитета.
Работа выполнена в рамках партнерского проекта Международного научно-технического центра (ISTC) #1197p, поддержанного программой Cooperative Threat Reduction Департамента Обороны США.