Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

Несмотря на большое количество исследований, посвященных изучению тревожных расстройств в эксперименте и клинике, патогенетические механизмы возникновения и развития этих состояний остаются до сих пор во многом неясными [1]. Наличие повышенной тревожности повышает вероятность инфаркта миокарда в 2,3 раза, а внезапной смерти - в 4,5 раза [13]. Близнецовые исследования выявили, что наследуемость такой черты, как тревожность, составляет около 45 % [7]. Это обосновывает правомерность поиска молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к повышенной тревожности.

На современном этапе одним из наиболее перспективных направлений при исследовании патогенетических механизмов тревожных расстройств является изучение животных, которые имеют генетические различия в характере ответа на эмоционально - стрессовые воздействия [1].

В ранее проведенных исследованиях [3, 4] на основании сравнительного анализа характеристик поведения двух групп крыс линии WAG/Rij, гомозиготных (А₁ /А₁ и А₂ /А₂) по локусу TAG 1A гена рецептора второго типа (DRD₂) в условиях новизны обстановки, было установлено наличие значимых межгрупповых различий. Крысы с генотипом А₁ /А₁ (далее А1А1) по сравнению с крысами с генотипом А₂ /А₂ (далее А2А2) проявляли большую двигательную активность и более выраженную исследовательскую деятельность. На основании этих результатов было высказано предположение, что крысы А2А2 имеют больший уровень тревожности и проявляют пассивную стратегию приспособительного поведения в отличие от другой группы, паттерн поведения которой может быть охарактеризован как активная стратегия поведения.

Анализ ежедневной (на протяжении всех десяти дней) динамики поведенческих реакций позволил углубить эти представления, показав, что крысы А1А1 в первые пять дней тестирования проявляли неадекватную в условиях новизны обстановки реакцию в форме гиперактивности [5]. У крыс А2А2, ни со стороны двигательной активности, ни со стороны исследовательской деятельности не отмечалось значимых изменений. Крысы во время всех посещений «открытого поля» мало передвигались, часто застывая на месте, совершая единичные стойки, количество которых в первый день эксперимента было вдвое меньше, чем у крыс А1А1. Эти данные показали, что крысы А2А2 имеют высокую базовую тревожность.

Целью данного сообщения является изложение результатов сравнительной оценки частот генотипов и аллелей полиморфного локуса NcoI гена DRD2 в двух группах крыс линии WAG/Rij, различающихся по уровню базовой тревожности, и сопоставление полученных результатов с содержанием дофамина (ДФ) и его метаболита 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) в центре афферентного синтеза - миндалевидном комплексе мозга (МК).

Все эксперименты проведены с соблюдением норм биомедицинской этики. Исследование полиморфного локуса NcoI гена DRD2 выполнено на 90 крысах (по 45 крыс в группах), содержание ДФ и ДОФУК в МК определяли, используя 70 крыс (по 35 в группе), методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для генетического анализа ДНК была выделена из лимфоцитов периферической крови с использованием метода Мэтью [12]. Амплификацию локуса NcoI DRD2 проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на амплификаторе «Терцик» производства г.Пущино с использованием ДНК-полимеразы Termus aguaticus производства фирмы «Биотекс» (Москва). Праймеры

5´-GAAACAGACGCCCAACAGGAC-3´

5´-CCAGAAACCGCGAAAGAAGAT-3´

были подобраны с помощью программы Primer3 (http://frodo.wi.edu/primer3) с.н.с. отдела геномики человека (зав. - проф. Э.К. Хуснутдинова) Института биохимии и генетики УНЦ РАН Казанцевой А.В. Для определения нуклеотидных замен использовали метод анализа ПЦР-ПДРФ. После денатурации (3 мин при 94о) выполняли 34 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 30 секунд при 94о, синтез ДНК 1,5 мин - при 59о, денатурация - 1 мин - при 72о, затем пробы выдерживали 5 мин - при 72о, охлаждали. Для выявлениz полиморфизма, 10 мкл реакционной смеси обрабатывали 3 единицами рестриктазы - NcoI. В результате реакции аллель N₁ локуса NcoI длиной 446 пар оснований оставался интактным, а N₂ подвергался ферментативному гидролизу. Длины фрагментов N₂ были равны 252 и 194 пар оснований. Результаты рестрикционного анализа оценивали при проведении электрофореза в 7 % полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете.

Содержание ДФ и ДОФУК в МК определяли на высокоэффективном жидкостном хроматографе (Аквилон, Россия) со спектрофотометрическим детектором (UVV-104 M). Область МК выделяли из нативного мозга и гомогенизировали в 20 объемах холодной 0,1 М перхлорной кислоты (Sigma, USA) и 1 пг/50 мкл дигидроксибензиламина гидробромида (ДГБА, Sigma, USA) в качестве внутреннего стандарта. Гомогенизат центрифугировали (при-20 оС) в течение десяти минут при 6000 оборотов в минуту. Супернатант подвергали микрофильтрации с помощью специальных наборов фирмы «Биохром» (Россия). После повторного центрифугирования пробы анализировали. Статистическую обработку проводили в программном пакете Statistica 5,5.

Результаты оценки распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса NcoI гена DRD2 в группах крыс линии WAG/Rij (А1А1 и А2А2), представлены в таблице.

Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного маркера NcoI гена DRD2 крыс линии WAG/Rij (А1А1 и А2А2) 

В обеих группах крыс обнаружено три генотипа: N1/N1, N1/N2, N2/N2. В группе крыс А2А2, характеризующихся повышенным уровнем тревожности, преобладает генотип N1/N2 (с частотой 0,43), следующим по частоте является генотип N2/N2 (0,30), а частота генотипа N1/N1 составляет 0,27. Частота встречаемости аллелей составляет 0,49 (N1) и 0,51 (N2). В группе крыс А1А1 генотипы имеют следующую частоту: N1/N1 - 0,45, N2/N2 - 0,45, наиболее редкий генотип N2/N2 - 0,09. Частота встречаемости аллелей составляет 0,68 (N1) и 0,32 (N2). Распределение частот генотипов и аллелей в выборках соответствует распределению Харди-Вайнберга (р = 0,993 для крыс А1А1 и р = 0,602 для крыс А2А2).

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов локуса NcoI гена DRD2 показал статистически значимые различия между группами крыс как в распределении частот аллелей (χ2 = 5,76, df = 1, p = 0,016), так и генотипов (χ2 = 6,67, df = 2, p = 0,035). Дальнейший анализ выявил, что в группе крыс А2А2 с повышенным уровнем тревожности имеет место статистически значимое увеличение частоты генотипа N2/N2 (χ2 = 4,66, df = 2, p = 0,031) и аллеля N2 (χ2 = 5,76, df = 1, p = 0,016) по сравнению с частотами аллелей и генотипов в группе крыс А1А1. Таким образом, установлено, что маркером повышенной тревожности крыс А2А2 является генотип N2/N2 локуса NcoI (OR = 4,29, 95 %CI 1,17-17,76) и аллель N2 (OR = 2,25, 95 %CI 1,14-4,43).

Анализ содержания ДФ, ДОФУК в МК показал, что при почти равных количествах содержания в ткани МК ДОФУК (p > 0,05), содержание ДФ значимо больше у крыс А1А1 (p < 0,01). Соотношение ДОФУК/ДФ вдвое меньше (0,17 ± 0,03 против 0,39 ± 0,03) у крыс А1А1, что указывает на его ускоренный метаболизм. Эти результаты показывают, что тревожность крыс А2А2 связана со сниженным содержанием ДФ и замедленным его метаболизмом в МК, который является ведущей структурой мозга в определении стратегии поведения.

Итак, результаты исследования показывают, что у крыс А2А2 пассивная стратегия поведения, обусловленная высокой базовой тревожностью, связана с генотипом N2/N2 локуса NcoI и наличием аллеля N2, сниженным содержанием дофамина и замедленным его метаболизмом в ключевой структуре лимбической системы - МК. Роль МК в формировании тревожности показана различными методами в многочисленных исследованиях на человеке и животных [8, 10].

На основании полученных нами данных можно предполагать, что между двумя изученными полиморфными локусами гена DRD2 - TAG 1A и NcoI - существует связь, и гаплотип DRD2 A2/N2 предопределяет повышенную тревожность крыс А2А2. В пользу этого суждения говорят данные Казанцевой [2], показавшей в исследованиях на людях, что у мужчин русской этнической принадлежности повышенный нейротизм (черта тревожного ряда) ассоциирован с гаплотипом DRD2 A2/N2.

В составе DRD2 описано несколько десятков полиморфных локусов, функциональное значение которых интенсивно изучается в последние годы [14]. Показано, что минорные аллели ряда полиморфных локусов этого гена (rs2283265 и rs1076560) снижают экспрессию короткой изоформы рецептора (DRD2S), которая располагается пресинаптически и представляет собой ауторецептор. В популяции крыс WAG/Rij аллель А1 в локусе TAG 1A является минорным, что позволяет предполагать, что его наличие будет приводить к тому же эффекту, который показан в отношении указанных выше локусов. А это значит, что будет определяться повышенное содержание дофамина, что и выявлено нами в МК у крыс А1А1. Исследования проведенные на добровольцах с помощью метода позитронно-эмиссионной томографии с введением ([18F]FDOPA), радиоактивного аналога предшественника дофамина L-DOPA, показали, что у носителей аллеля А2 (с генотипом А2/А2) снижена активность ДОФА-декарбоксилазы, конечного энзима в синтезе дофамина [11].

Ген DRD2 является наиболее распространённым вариантом дофаминовых рецепторов. Он встречается в коре головного мозга, в среднем мозге, и особенно широко распространен в лимбической системе. От режима функционирования данных рецепторов и уровней дофамина зависит стратегия приспособительного поведения [6]. Предполагается, что в норме существует сбалансированная функциональная активность пре- и постсинаптических DRD2 рецепторов в головном мозге. При нарушении этого баланса могут формироваться определенные особенности дофаминергической трансмиссии и возникать отклонения в адаптивном поведении [9].

Авторы приносят благодарность заведующему отделом геномики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН заслуженному деятелю науки РФ, профессору, доктору биологических наук Хуснутдиновой Эльзе Камилевне за консультативную помощь.

Список литературы

1. Башкатова В.Г. // Психофармакология и биологическая наркология - 2008. - Т. 8, №1-2. - С. 17.
2. Казанцева А.В., Гайсина Д.А., Малых С.Б., Хуснутдинова Э.К. // Медицинская генетика. - 2008. - №3. - С. 3.
3. Леушкина Н.Ф., Калимуллина Л.Б. // Успехи современного естествознания. - 2008. - №10. - С. 18.
4. Леушкина Н.Ф., Калимуллина Л.Б. // Успехи современного естествознания. - 2010. - №10. - С. 14-20.
5. Леушкина Н.Ф., Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. // Успехи современного естествознания. - 2011.
6. Шаляпина В.Г. Основы нейроэндокринологии. - СПб.: Элби, 2005. - 156 с.
7. Benjamin J., Ebstein R., Belmaker H. // American Psychiatric Publishing Inc. - 2002. - Р. 356.
8. Bremner J. // Expert Rev Neurother. - 2004. - Vol. 4, № 2. - Р. 275.
9. Brown S.L., Steinberg R.L.,Van Praag H.M. // Handbook of depression and anxiety. - 1994. - Р. 313
10. Charney D. // Acta Psychiatr Scand. - 2003, Suppl. - Vol. 417. - Р. 38-50.
11. Laakso A., Pohjalainen T., Bergman J. et al. // Pharmacogenet Genomics. - 2005. - Vol. 15, №6. - Р. 387.
12. Mathew С.C. Methods in Molecular Biology / Ed. Walker J.M. - New York: Human Press, 1984. - Vol. 2. - P. 31.
13. Roy-Byrne P. P., Katon W. // J. Clin. Psych. - 1997. - № 58. Suppl. 3. - Р. 34.
14. Zhang Y., Bertolino A., Fazio L.et al. // PNAS. - 2007. - Vol. 104, №51. - Р. 20557.