Иммобилизация - ключевой момент в получении стабильного распознающего элемента биосенсора, от которой зависит сама возможность измерения сигнала, операционные характеристики сенсора, чувствительность и селективность определения биологических компонентов в смесях сложного состава. Метод иммобилизации должен быть применим в достаточно широких диапазонах температур, значений pH и давлений, обеспечивать хорошую воспроизводимость при серийном производстве сенсоров.
В качестве носителя для иммобилизации бактериальных клеток Gluconobacter оxydans использовали пленку из поливинилового спирта (ПВС), модифицированного N-винилпирролидоном.
При получении ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном использовали методику сополимеризации ПВС с N-винилпиридином [1].
Для приготовления ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном раствор, содержащий ПВС, нитрат церия-аммония и N-винилпирролидон перемешивали при 40°С в атмосфере азота в течение 3-х часов [1].
В ходе эксперимента варьировали соотношение ПВС:N-винилпирролидон:катализатор.
Качество полученных пленок оценивали по их растворимости в буферном растворе и по ИК-спектрам, которые сравнивали со спектрами исходных веществ.
С увеличением содержания катализатора в ИК-спектре ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном уменьшается, а затем и полностью исчезает полоса при 1625 см-1, характерная для области валентных колебаний С = С - связи, что подтверждает разрыв двойных С = С - связей в N-винилпирролидоне.
Увеличение содержания N-винилпирролидона приводит к появлению полосы 1625 см-1 (νС=С) и к растворимости полученных пленок в буферном растворе, так же, как и уменьшение количества катализатора.
Пленки, полученные простым смешиванием растворов ПВС и ПВП, после высушивания растворяются в буферном растворе, что служит косвенным доказательством сетчатой структуры полученного полимера.
Предполагаемый механизм сшивки с участием ионов Ce+4 в качестве инициатора, приводящего к появлению оксильных радикалов, приведен ниже:
Предполагаемый механизм сшивки поливинилового спирта N-винилпирролидоном
Известна иммобилизация микроорганизмов в криогель поливинилового спирта, с целью получения стабильных рецепторных элементов биосенсоров [2]. Для увеличения долговременной и операционной стабильности биорецепторных элементов в настоящей работе была проведена иммобилизация бактериальных клеток в пленку ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном, т.к. известно, что N-винилпирролидон способен образовывать пленки с ПВС [3] и нетоксичен для микроорганизмов.
В ходе работы показано, что при иммобилизации бактерий Gluconobacter оxydans в пленку на основе модифицированного поливинилового спирта, увеличивается долговременная стабильность сенсоров в 3-4 раза, чувствительность на глюкозу и этанол в 9 и 40 раз, соответственно, значительно снижается предел обнаружения определяемых субстратов, а также время проведения анализа, по сравнению с аналогичными характеристиками в криогеле поливинилового спирта [2]. Установлено, что биорецепторные элементы, полученные иммобилизацией бактериальных клеток в такую пленку сохраняют свои рабочие характеристики при хранении в сухом виде при температу-
ре = +4ºС в течение трех недель.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2009-2013 г.) госконтракт №02.740.11.0296.
Список литературы
- Bin Li, Li Niu, Wenpeng Kou, Qing Deng, Guangjin Cheng, Shaojun Dong. Synthesis of a Self-Gelatinizable Grafting Copolymer of Poly (vinyl Alcohol) for Construction of an Amperometric Peroxidase Electrode // Analytical Biochemistry. - 1998. - P. 130-132.
- Асулян Л.Д. Иммобилизация клеток Gluconobacter oxydans для создания стабильных рецепторных элементов биосенсоров // Изв. ТулГУ. Сер. Химия. - 2006. - Вып. 6. - С. 137-144.
- Базилюк Т.Н., Мельник Н.П., Менжерес Г.Я. Модификация поливинилового спирта поли-N-винилпирролидоном // Вопросы химии и химической технологии. - 2003. - №1. - С. 57-60.