Проблема приспособления организма к окружающей его среде всегда была в центре внимания биологов и медиков различных специализаций. Адаптация организма к факторам среды может осуществляться как за счёт организменных (системных), так и за счёт клеточных механизмов. Живые организмы постоянно находятся под влиянием разнообразных физических и химических факторов как естественного, так и искусственного происхождения. Поэтому в этих условиях очень важно правильно оценить особенности реакции организма в целом, а также, что важно, резистентность клеток, а следовательно и тканей, в экстремальных условиях. Например, известно, что основная роль в адаптации морских моллюсков к колебаниям солёности принадлежит устойчивости именно клеток (Бергер, 1986; Филиппов и др., 2005; Филиппов, 2007).
Следует отметить, что существенным элементом устойчивости клеток к действию повреждающего агента является способность клеток бороться с последствиями этого воздействия. Этот динамический компонент устойчивости - противодействие повреждению - может проявляться как во время действия агента, так и после его прекращения (Арронет, 1963). Например, установлено, что растительные клетки способны репарировать тепловое повреждение, значительно превышающее то, которое необходимо для полной остановки движения их цитоплазмы. Кроме того, устойчивость протоплазмы к повреждению находится в связи с содержанием в клетках некоторых антиденатураторов. Указывается, например, что в мышцах с пониженным содержанием аденозинтрифосфата (АТФ) и гликогена окоченение наступает более быстрее, нежели в мышцах, содержащих значительный запас этих веществ (Браун и др., 1959).
В ходе предыдущих исследований нами было установлено, что 0,1 % концетрация соляной, фосфорной и уксусной кислот приводит к торможению мукоцилиарного транспорта пищевода лягушки, но после электромагнитной стимуляции в ряде случаев восстанавливалась активность мукоцилиарного транспорта (Буриков и др., 2009; Нехороший, 2010). Возможно, что электромагнитное излучение выступает в качестве своеобразного «антиденатуратора» или стимулирует активность разнообразных внутриклеточных антиденатураторов. Поэтому мы установили направление следующей серии экспериментов, целью которых явилось изучение устойчивости мерцательного эпителия пищевода лягушки озёрной (Rana ridibunda) по отношению к соляной, фосфорной и уксусной кислотам (с 0,1 % концентрацией), а также исследование изменения кислотной устойчивости мерцательного эпителия при электромагнитной стимуляции.
Методы и материалы исследования
Исследование проведено на половозрелых лягушках озёрных (Rana ridibunda, Pallas, 1771) (обоего пола, массой 100-200 грамм). Озёрные лягушки отлавливались в реке Дон в окрестностях г. Ростова-на-Дону. Животные содержались в условиях вивария при температуре 20-25 ºС в ваннах с дехлорированной водопроводной водой.
Испытуемых животных декапитировали, а затем обездвиживали разрушением центральной нервной системы, которое было осуществлёно следующим способом: тупая бранша ножниц вводилась между челюстями, остроконечная - располагалась позади глаз, отсекалась одним движением голова, и производилось окончательное разрушение центральной нервной системы введением в позвоночный канал круглого зонда. Расправляли конечности лягушки, клали ее на спину в ванночку, оттягивая пинцетом кожу в нижней части брюха и надрезая ее ножницами. Вводили в разрез тупую браншу ножниц, и оттягивая все время кожу кверху, чтобы не повредить нижележащие мышцы, делали разрез от заднего конца тела до ротового отверстия. В области передних конечностей производились поперечные разрезы кожи. Кожные лоскуты отворачивались в сторону и закалывались фиксирующими булавками.
Оттягивая кверху пинцетом мышечную стенку задней части живота, прорезали ее и, введя в разрез тупую браншу ножниц и все время приподнимая ею мышечную стенку (чтобы не повредить внутренние органы), проводили разрез вперед, в 3-4 мм сбоку от брюшной вены вплоть до начала ротовой полости. Особенно осторожно перерезался пояс передних конечностей, под которым лежит сердце с отходящими от него сосудами. Второй разрез проводили таким же образом, но с другой стороны от брюшной вены.
Пинцетом осторожно отводили мышечные стенки в стороны (при необходимости подрезая ножницами тонкие пленки, идущие к внутренним органам) и закалывали их булавками; брюшная вена оставалась на месте в мышечном лоскуте. Затем вводили одну браншу ножниц в пасть и разрезали по средней линии нижнюю челюсть и пищевод вплоть до желудка. Вырезали фрагмент ротоглоточной полости, пищевод и часть желудка (Коган и др., 1954).
Отпрепарированный пищевод лягушки разрезали на 8 фрагментов. Для их переживания in vitro использовали физиологический раствор. Из литературных источников известно, что мерцательный эпителий пищевода лягушки в физиологическом растворе способен функционировать в течении нескольких часов.
Тканевой материал перед опытом многократно промывали стерильной водой (вода для инъекций) с помощью одноразового шприца (на 2 мл).
Для изучения кислотной устойчивости мерцательного эпителия фрагменты пищевода орошали 0,1 % растворами соляной, фосфорной и уксусной кислот. После химической обработки, фрагменты пищевода подвергали электромагнитной стимуляции (с частотами в 1, 5, 10 и 15 Гц). Кусочки пищевода микроскопировали с использованием микроскопа стереоскопического панкратического МСП-1 (Россия). Электромагнитную стимуляцию осуществляли с помощью магнитного стимулятора «Нейро-МС» (Россия), который предназначен для генерации электромагнитных импульсов высокой интенсивности. Регистрировали время наркотизации, т.е. время от начала орошения кислотой и электромагнитной стимуляции до полной остановки движения ресничек. Время прекращения активности мерцательного эпителия являлось критерием клеточной кислотной устойчивости.
Результаты оценки кислотной устойчивости мерцательного эпителия при химических и электромагнитных стимуляциях вносились в базы данных MS Office Excel 2007. Достоверность различий между группами оценивали по t-критерию Стьюдента (для независимых выборок) после проверки распределения на нормальность (Лакин, 1990).
Результаты исследования и их обсуждение
По результатам нашего исследования время переживания мерцательного эпителия при действии 0,1 % раствора соляной кислоты составило 55,9 ± 3,23 секунды (контроль). После электромагнитной стимуляции (ЭМС) с частотой в 1 Гц, время активности мерцательного движения недостоверно увеличилось на 13 % по сравнению с контролем. ЭМС с частотами в 5, 10 и 15 Гц приводила к достоверному увеличению активности на 31,8 % (р < 0,001), на 42,6 % (р < 0,001) и на 58,9 % (р < 0,001) соответственно, в сравнении с контрольной группой.
Устойчивость мерцательного эпителия под влиянием 0,1 % фосфорной кислоты (ФК) равна 50,4 ± 3,81 секундам. ЭМС с частотой в 1 Гц недостоверно продлила устойчивость на 16,3 % относительно контрольного показателя. ЭМС с частотами в 5, 10 и 15 Гц достоверно увеличила толерантность мерцательного эпителия по отношению к контрольному значению на 32,3 % (p < 0,05), 47,2 % (р < 0,001), 65,5 % (р < 0,001) соответственно.
Кислотный наркоз мерцательного эпителия под влиянием 0,1 % уксусной кислоты был равен 44,9 ± 3,56 секундам. Кислотная устойчивость мерцательного эпителия в условиях ЭМС в 1 Гц недостоверно возрастала на 18,3 %. ЭМС с частотой в 5 Гц приводила к увеличению устойчивости на 38,1 % (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой. ЭМС с частотами в 10 и 15 Гц повышала устойчивость на 56,8 (р < 0,001) и 71 % (р < 0,001) соответственно (в сравнении с уровнем контроля).
Выводы
В основе реакции клеток на действие кислот лежат денатурационные изменения клеточных белков, т.е. изменение их пространственной организации, а следовательно потеря функциональной активности. Из результатов видно, что клетки мерцательного эпителия оказались более устойчивыми к соляной кислоте и менее устойчивыми к уксусной кислоте, так как неорганические кислоты проникают в клетку медленнее, чем органические кислоты (Бреслер и др., 1981). Отсюда следует, что различия в кислотной устойчивости тканей должны быть обусловлены различной устойчивостью клеточных белков. Встаёт вопрос о роли в адаптации животных и человека к химическим условиям среды самых нижних уровней организации - клеточного и молекулярного, в частности, белкового.
Электромагнитная стимуляция (с повышением частоты) вызывает увеличение продолжительности времени активности мерцательного эпителия, т.е. его устойчивость по отношению к 0,1 % растворам соляной, фосфорной и уксусной кислот. Следовательно, электромагнитная стимуляция с крайне низкими частотами выступает в качестве антиденатуратора, возможно, стимулируя внутриклеточные процессы репарации на молекулярном уровне.
Список литературы
- Арронет Н.И. Репарация теплового повреждения мерцательными клетками личинок некоторых брюхоногих моллюсков // Цитология. - 1963. - Т. 5, №2. - С. 222-227.
- Бергер В.Я. Адаптации морских моллюсков к изменениям солёности среды. - Л.: Наука, 1986. - 214 с.
- Браун А.Д., Несветаева Н.М., Фиженко Н.В. Об устойчивости актомиозина травяной и озёрной лягушек к денатурирующему действию тепла и спирта // Цитология. - 1959. - Т. 1, №1. - С. 86-93.
- Бреслер В.М., Никифоров А.А. Транспорт органических кислот через плазматические мембраны дифференцированных эпителиальных слоёв у позвоночных. - Л.: Наука, 1981. - 203 с.
- Буриков А.А., Кутенко М.А., Нехороший А.А. Возможность применения мерцательного эпителия в медицинском микробиороботостроении // Известия Южного федерального университета. Технические науки. - 2009. - №10. - С. 203-208.
- Коган А.Б., Щитов С.И. Практикум по сравнительной физиологии. - М.: Советская наука, 1954. - 548 с.
- Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.
- Нехороший А.А. Общая оценка мукоцилиарного транспорта пищевода лягушки озёрной в ситуации электромагнитной стимуляции после предварительной химической обработки // Биология-наука 21 века: материалы 14-й международной Пущинской школы-конференции молодых учёных. - Пущино, 2010. - Т.1. - С. 162.
- Филиппов А.А. Адаптивные способности беломорских мидий Mytilus edulis (Bivalvia, Mytilidae) к изменению солёности среды обитания // Зоологический журнал. - 2007. - Т. 86, № 4. - С. 415-420.
- Филиппов Н.А., Филиппов А.А. Динамика клеточной устойчивости мерцательного эпителия беломорских двустворчатых моллюсков Macoma balthica L. в ходе акклимации к пониженной солёности // материалы 6-й науч. сессии мор. биол. станции СПб. университета. - СПб., 2005. - С. 33-34.