Из широкого спектра загрязнителей особую опасность для гидробионтов представляют тяжелые металлы [1, 2]. Важную роль в метаболизме, росте и развитии, а также адаптации гидробионтов к различным видам токсической нагрузки играют белки [3, 7].
Свинец и кадмий относятся к 1 классу токсичности. Из всех водных обитателей наибольшее токсическое действие кадмий и свинец оказывают на рыб [1]. К таким воздействиям относится образование комплекса «белок-металл» с накоплением металлотионеинов, нарушение процессов образования и транспорта белков и другие реакции, показателями которых могут являться изменения в содержании различных белков в организме.
Однако, все еще мало сведений, касающихся влияния металлов, которые выступают в низких концентрациях как микроэлементы, а при высоких - проявляют свойства тяжелых металлов. К таким металлам относится марганец, который как микроэлемент препятствует развитию свободно - радикального окисления, обеспечивая стабильность структуры клеточных мембран, нормальное функционирование мышечной ткани, а также повышает интенсивность утилизации жиров, снижая уровень липидов в организме, необходимый для нормального роста и развития организма. При хроническом отравлении соединения марганца выступают как цитоплазматические яды, способные вызывать серьезные нарушения в нервной системе, почках и органах кровообращения [2].
Целью данной работы явилось изучение влияния хронической интоксикации водной среды ионами свинца, кадмия и марганца на белковый состав крови сеголеток карпа.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на базе лаборатории анатомии, физиологии, гистологии Дагестанского государственного университета. В эксперименте использованы сеголетки карпа (Cyprinus carpio L.) массой 100-150 г, выращенные в прудах Широкольского рыбоводного комбината Республики Дагестан. Рыбы отлавливались перед их переброской в пруды для зимовки и переносились в аквариумы объемом 250-300 литров с содержанием ацетата свинца 0,5 мг/дм3 (ПДК 0,1 мг/дм3), хлорида кадмия 0,25 мг/дм3 (ПДК 0,005 мг/дм3) и сульфата марганца 0,1 мг/дм3 (ПДК 0,01 мг/дм3). Контролем служили рыбы, содержавшиеся в чистой воде. В аквариумах создавались условия постоянного температурного (19-23 °С) и газового режима. Кормили рыб живым трубочником Tubifex tubifex. Изучали динамику содержания общего белка [8] и белковых фракций [5] в крови сеголеток карпа в разные сроки экспозиции рыб в водной среде с ионами тяжелых металлов (5, 15, 30 и 40 дни эксперимента).
Полученные результаты подвержены вариационно - статистической обработке методом малой выборки [6].
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования представлены в табл. 1-3 и на рис. 1-3.
Из полученных данных видно, что содержание белков в крови сеголеток карпа находится в зависимости от вида и времени действия токсиканта.
У контрольных рыб содержание белков в крови составляет 24,0 ± 1,30 г/л. Большая их часть (40,0 %) приходится на долю альбуминовой фракции. Остальные белки представлены α1 - (24,0 %), α2 - (18,0 %), β - (6,0 %) и γ - (7,0 %) глобулинами. A/G-индекс контрольных рыб равен 0,67, что свидетельствует о преобладании суммы глобулинов над альбуминами в 1,5 раза.
При действии ионов кадмия в течение 40 суток наблюдается значительное повышение содержания белков всех фракций, кроме β-глобулинов, уровень которых меняется незначительно на протяжении эксперимента. Так, наиболее значительное повышение содержания общего белка, альбуминов и α1-глобулинов (~ в 2,0 раза) отмечено на 15 день эксперимента. В дальнейшем происходит снижение концентрации протеинов, однако, значение их не достигает уровня контроля (за исключением содержания α1-глобулинов). Наибольшие концентрации α2- и γ-глобулинов обнаружены на 30 и 40 сутки соответственно. Изменения в соотношении белковых фракций сопровождаются ростом A/G - индекса, наибольшее значение которого (1,58) отмечено на 30 сутки, что свидетельствует о значительном преобладании альбуминовой фракции над глобулиновой на данном этапе экспозиции (табл. 1; рис. 1).
Таблица 1
Содержание общего белка и белковых фракций в периферической крови сеголеток карпа при хронической интоксикации ионами кадмия (М ± m, n = 10)
|
Условия опыта
Белок и белковые |
Контроль |
5-й день |
15-й день |
30-й день |
40-й день |
|
|
Общий белок (г/л) |
24,0 ± 1,30 |
46,0 ± 0,09** |
48,0 ± 0,19** |
38,0 ± 0,19** |
30,0 ± 0,31** |
|
|
Альбумины |
г/л |
9,6 ± 0,80 |
19,3 ± 0,20** |
19,9 ± 0,18** |
9,1 ± 0,12 |
9,0 ± 0,09 |
|
% |
40,0 |
42,0 |
41,5 |
24,0 |
30,0 |
|
|
Глобулины |
||||||
|
α1-глобулины |
г/л |
5,8 ± 0,60 |
12,9 ± 0,29** |
14,4 ± 0,17** |
13,3 ± 0,09** |
9,0 ± 0,07* |
|
% |
24,0 |
28,0 |
30,0 |
35,0 |
30,0 |
|
|
α2-глобулины |
г/л |
4,3 ± 0,30 |
8,7 ± 0,13** |
9,6 ± 0,17** |
11,4 ± 0,09** |
7,5 ± 0,16** |
|
% |
18,0 |
19,0 |
20,0 |
30,0 |
25,0 |
|
|
β - глобулины |
г/л |
2,6 ± 0,20 |
2,8 ± 0,03* |
2,4 ± 0,14* |
3,0 ± 0,18 |
2,4 ± 0,03 |
|
% |
11,0 |
6,0 |
5,0 |
8,0 |
8,0 |
|
|
γ - глобулины |
г/л |
1,7 ± 0,20 |
2,3 ± 0,09* |
1,9 ± 0,02 |
1,1 ± 0,02* |
2,1 ± 0,09 |
|
% |
7,0 |
5,0 |
4,0 |
3,0 |
7,0 |
|
|
A/G |
0,67 ± 0,05 |
0,86 ± 0,14 |
0,97 ± 0,04* |
1,58 ± 0,02** |
0,41 ± 0,02* |
|
Здесь и далее: * - P < 0,01; ** - P < 0,001.
Очевидно, повышение содержания общего белка при воздействии ионов кадмия связано с тем, что данный токсикант, накапливаясь преимущественно в печени и почках гидробионтов [1], индуцирует синтез металлотионеинов, которые связывают ионы металла и действуют как ловушка для свободных радикалов, являясь, таким образом, естественной защитой организма.
Активация синтеза α2 - глобулинов при воздействии хлорида кадмия, вероятно, вызвана необходимостью связывания ионов кадмия, в таком виде они менее токсичны, хотя далеко не безвредны [4]. Кроме того, повышение содержания белковых фракций в крови сеголеток карпа может служить показателем функционального состояния печени в условиях интоксикации ионами кадмия.
Рис. 1. Динамика содержания белков и их фракций (в % по отношению к контролю)
в периферической крови сеголеток карпа при хроническом воздействии ионами кадмия:
1 - общий белок; 2 - альбумины; 3 - α1-; 4 - α2-; 5 - β-; 6 - γ-глобулины
При воздействии ионов свинца содержание общего белка в сыворотке крови сеголеток карпа повышается на 5 сутки на 30,4 %, снижается на 15 и 30 сутки на 14,2 и 16,3 % соответственно и стабилизируется в пределах контрольных величин к 40 дню. Уровень альбуминов ниже контроля на 15; 30 и 40 сутки на 47,9; 54,2 и 55,2 % соответственно, тогда как на 5 день их содержание повышено на 23,9 %. Относительно фракций глобулина можно отметить повышенное содержание всех его компонентов на протяжении всего эксперимента. При этом, максимальные значения α1 - (11,1 ± 1,50) и β - глобулинов (6,1 ± 1,20) отмечены на 5 сутки; α2-глобулинов (8,4 ± 1,50) - на 40 сутки и γ - глобулинов (4,5 ± 1,11) - на 15 день. К концу эксперимента процентное содержание α1-, α2- , β- и γ-глобулинов сохраняется на уровне выше контроля на 33,9, 65,0 и 106,0 % соответственно (табл. 2; рис. 2).
Таблица 2
Содержание общего белка и белковых фракций в периферической крови сеголеток карпа при хронической интоксикации ионами свинца (М ± m, n = 10)
|
Условия опыта
Белок и белковые |
Контроль |
5-й день |
15-й день |
30-й день |
40-й день |
|
|
Общий белок (г/л) |
24,0 ± 1,30 |
31,3 ± 1,10* |
20,6 ± 1,40 |
20,1 ± 3,50 |
24,0 ± 1 = 0,17 |
|
|
Альбумины |
г/л |
9,6 ± 0,80 |
11,9 ± 0,38* |
5,0 ± 1,20* |
4,4 ± 0,90* |
4,3 ± 1,50* |
|
% |
40,0 |
38,5 |
24,0 |
22,0 |
18,0 |
|
|
Глобулины |
||||||
|
α1-глобулины |
г/л |
5,8 ± 0,60 |
11,1 ± 1,50 |
8,4 ± 3,50 |
6,3 ± 2,40 |
7,9 ± 1,80 |
|
% |
24,0 |
35,8 |
40,1 |
31,3 |
33,0 |
|
|
α2-глобулины |
г/л |
4,3 ± 0,31 |
7,9 ± 1,10* |
4,6 ± 0,79 |
7,1 ± 1,29* |
8,4 ± 1,50* |
|
% |
18,0 |
25,8 |
21,9 |
35,3 |
35,0 |
|
|
β-глобулины |
г/л |
2,6 ± 0,20 |
6,1 ± 1,20* |
3,6 ± 0,89 |
4,0 ± 0,68 |
4,3 ± 1,28 |
|
% |
11,0 |
19,5 |
17,2 |
20,0 |
18,0 |
|
|
γ-глобулины |
г/л |
1,7 ± 0,22 |
2,3 ± 0,51 |
4,5 ± 1,11* |
2,8 ± 0,76 |
3,5 ± 0,87 |
|
% |
7,0 |
19,2 |
21,4 |
14,0 |
14,4 |
|
|
A/G |
0,67 ± 0,05 |
0,61 ± 0,06 |
0,32 ± 0,01* |
0,28 ± 0,03* |
0,22 ± 0,01* |
|
Рис. 2. Динамика содержания белков и их фракций (в % по отношению к контролю)
в периферический крови сеголеток карпа при хроническом воздействии ионами свинца:
1 - общий белок; 2 - альбумины; 3 - α1-; 4 - α2-; 5 - β-; 6 - γ-глобулины
Изменения в соотношении белковых фракций сопровождается (в отличие от интоксикации ионами кадмия) падением A/G-индекса, наименьшее значение которого (0,22) отмечено на 40 сутки, что свидетельствует о значительном преобладании суммарного содержания глобулинов над альбуминами.
Полученные данные об изменениях соотношения белковых фракций в крови сеголеток карпа при интоксикации ацетатом свинца являются показателем функционального состояния печени, где осуществляется синтез альбуминов и глобулинов. Подобного рода изменения в сыворотке крови можно рассматривать как защитную реакцию организма при воздействии ионов свинца, поскольку известно, что глобулины являются белками, участвующими в иммунных реакциях организма.
При хроническом воздействии сульфата марганца происходит снижение содержания общего белка на 5; 15 и 40 сутки на 33,8; 14,6 и 16,3 % соответственно и стабилизация в пределах нормы к 30 дню. Интоксикация ионами марганца сопровождается однотипными изменениями в сторону повышения уровня альбуминовой фракции на 5; 15; 30 и 40 сутки на 57,3; 72,9; 34,4 и 57,3 % соответственно по сравнению с контролем (табл. 3; рис. 3).
Таблица 3
Содержание общего белка и белковых фракций в периферической крови сеголеток карпа при хронической интоксикации ионами марганца (М ± m, n = 10)
|
Условия опыта Показатели |
Контроль |
5-й день |
15-й день |
30-й день |
40-й день |
|
|
Общий белок (г/л) |
24,0 ± 1,30 |
15,9 ± 0,10** |
20,5 ± 0,12* |
25,2 ± 0,41 |
20,1 ± 0,12* |
|
|
Альбумины |
г/л |
9,6 ± 0,79 |
15,1 ± 1,29* |
16,6 ± 2,10** |
12,9 ± 1,70* |
15,1 ± 0,18** |
|
% |
40,0 |
42,0 |
41,5 |
33,9 |
42,0 |
|
|
Глобулины |
||||||
|
α1-глобулины |
г/л |
5,8 ± 0,56 |
10,8 ± 1,10** |
11,2 ± 1,21** |
12,4 ± 1,40** |
8,1 ± 0,09* |
|
% |
24,0 |
30,0 |
28,0 |
33,0 |
28,0 |
|
|
α2-глобулины |
г/л |
4,3 ± 0,29 |
6,4 ± 0,57** |
8,4 ± 0,68** |
7,6 ± 0,59** |
6,4 ± 0,04* |
|
% |
18,0 |
19,0 |
21,0 |
20,0 |
22,0 |
|
|
β-глобулины |
г/л |
2,6 ± 0,20 |
1,8 ± 0,30 |
2,4 ± 0,41 |
3,9 ± 0,48* |
2,3 ± 0,13* |
|
% |
11,0 |
5,0 |
6,0 |
10,0 |
8,0 |
|
|
γ-глобулины |
г/л |
1,7 ± 0,18 |
1,4 ± 0,10 |
1,2 ± 0,12* |
1,1 ± 0,20* |
0,9 ± 0,02* |
|
% |
7,0 |
4,0 |
3,0 |
2,9 |
3,0 |
|
|
A/G |
0,67 ± 0,05 |
0,74 ± 0,09 |
0,72 ± 0,10 |
0,32 ± 0,06* |
0,84 ± 0,02 |
|
Рис. 3. Динамика содержания белков и их фракций (в % по отношению к контролю)
в периферической крови сеголеток карпа при хроническом воздействии ионами марганца:
1 - общий белок; 2 - альбумины; 3 - α1-; 4 - α2-; 5 - β-; 6 - γ-глобулины
Характерным для ионов марганца является значительное повышение содержание фракций α1 - и α2-глобулинов. Максимальные значения α1-глобулинов (12,4 ± 1,40) отмечены на 30 сутки, α2-глобулинов (8,4 ± 0,68) - на 15 день. На 5; 15 и 40 сутки воздействия ионов марганца уровень β-глобулинов снижен на 30,8; 7,7 и 10,8 % соответственно и повышен на 50,0 % на 30 сутки по сравнению с контролем. Воздействие сульфата марганца сопровождается снижением γ-глобулиновой фракции на протяжении всего эксперимента, особенно выраженном на 40 сутки (на 48,8 % по сравнению с контролем).
Таким образом, при марганцевой интоксикации отмечаются разнонаправленные изменения в содержании белковых фракций в периферической крови сеголеток карпа, что нашло отражение в изменении A/G-индекса. На 5, 15 и 40 сутки соотношение A/G возрастает, тогда как на 30 сутки в 2,0 раза ниже, по сравнению с контролем.
Механизм воздействия марганца как тяжелого металла на белковый обмен рыб можно связать с его вступлением в тесную связь со многими белками и ферментами. В растворах воздействие ионов марганца проявляется в ярко выраженном каталитическом действии, то есть способности в сотни тысяч и миллионы раз ускорять течение химических реакций. Кроме того, показано действие ионов марганца на синтез белков и нуклеиновых кислот.
Исходя из полученных данных можно заключить, что состав белков сыворотки крови сеголеток карпа подвержен изменениям, как при действии токсичных металлов, так и эссенциальных. Особенности действия тяжелых металлов проявляются в характере их влияния на соотношение альбуминов и глобулинов: при действии ионов кадмия обнаруживается четко выраженная тенденция преобладания содержания альбуминов над глобулинами на протяжении всего эксперимента, тогда как при действии ионов свинца, напротив, характер соотношения меняется в сторону преобладания доли глобулиновой фракции.
Таким образом, полученные данные служат важным информативным показателем оценки изменений, наблюдаемых на организменном или видовом уровнях гидробионтов и основанием для использования показателей белкового обмена рыб в качестве биотеста, экологического мониторинга и экологических экспертиз водных экосистем.
Список литературы
- Амосова А.А. Оценка токсического воздействия соединений кадмия на водные организмы // IX Съезд Гидробиологического общества РАН. Т.1. - Тольятти, 18-22 сентября, 2006. - С. 16.
- Давыдова С.Л. О токсичности ионов металлов // Химия. - 1991. - № 3. - С. 121-123.
- Ерохина И.А. К вопросу об изменчивости белкового состава плазмы крови морских млекопитающих // Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики: материалы II Междунар. научн. конф. - Саранск: Типография ООО «Мордовия-ЭКСПО». - 2009. - С. 46-49.
- Иванова В.П. К вопросу о механизме токсического действия кадмия на живые организмы // Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных: материалы II Междунар. научн. конф. - Саранск. - 2009. - С.58-60.
- Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. - М.: МЕДпресс-информ, 2004. - 910 c.
- Лакин Г.Ф. Биметрия. - М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.
- Синюк Ю.В. Обмен аминокислот и фракционный состав белков в организме карпа под действием ионов марганца, цинка, меди и свинца: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Л., 2003. - 16 с.
- Lowry O.R. Protein measurement with folin phenol reagent / O.R. Lowry, N.P. Rosebrouph, A.N. Farr, R.K. Randall // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193, №1. - P. 265-275.