Кровопотеря представляет собой комплекс компенсаторных и патологических реакций, возникающих в ответ на кровотечение [4]. К адаптивным механизмам компенсации кровопотери относят активацию свертывающей системы крови и процессы тромбообразования, реакции со стороны сердечно-сосудистой системы, восстановление белкового состава крови, устранение дефицита форменных элементов [2, 5].
Известно, что кровопотеря сопровождается активацией системы иммунитета, что проявляется в появлении активированных лимфоцитов, увеличение уровня антител, активацией реакции неспецифического иммунитета [5, 7]. Основное место в регуляции системы иммунитета отводится медиаторам в том числе, щелочным полипептидам – цитомединам, которые являются пептидами межклеточной регуляции и обеспечивают гомеостаз организма. Последние образуются в клетках различных органов в результате катепсинового протеолиза, проникают в жидкие среды организма и способны специфическим образом через рецепторы воздействовать на лимфоциты.
Многочисленными исследованиями установлено, что самые различные форменные элементы крови способны взаимодействовать друг с другом, образуя агрегаты. В частности, все без исключения виды лейкоцитов способны вступать во взаимодействие с тромбоцитами и кровяные пластинки, активируясь, могут присоединять к себе эритроциты [5, 6]. Одним из перспективных направлений исследования адаптационных реакций организма в ответ на острую кровопотерю является изучение свойств эндогенных пептидов (цитомединов), продуцируемые органами, тканями и клетками, способные вмешиваться в реализацию самых различных функций организма [1, 2].
Цель работы: изучить биологические свойства пептидов, выделенных из печени и сердца животных, перенесших острую кровопотерю на адгезивные свойства клеток крови.
Материал и методы исследования
Эксперименты проведены на 20 животных (бараны). Все животные были разделены на 2 группы: опытные (10 баранов), которым пунктировали яремные вены и извлекали кровь в объеме равной 30 % ОЦК за 5 дней до забоя и контрольные без предварительного кровопускания (10 баранов). Забой проводился в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение 4 к Приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977). Для получения цитомединов были взяты внутренние органы баранов – ткани печени и сердца. Выделение цитомединов проводилось методом уксусно-кислой экстракции с последующим осаждением комплекса полипептидов ацетоном (В.Г. Морозов и В.Х Хавинсон, 1999).
Цитомедины, полученные из печени и сердца баранов, которым за пять дней до забоя вскрывались яремные вены и выводилась кровь в объеме равной 30 % ОЦК, были названы опытными. Контрольные цитомедины были получены из печени и сердца животных без предварительного кровопускания.
Нами проводилось исследование биологической активности цитомединов на 15 образцах крови доноров в возрасте от 18 до 25 лет (средний возраст 19,3 ± 1,8 года), не имеющих соматических, психических заболеваний.
Исследуемые пептиды, в конечной концентрации 10 мкг/мл, инкубировали с цитратной кровью доноров 60 минут при 37 °С, затем центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течение 10 минут. Количество агрегатов форменных элементов крови оценивали по методу Д.И. Бельченко (1993).
Полученные данные были обработаны статистически общепринятыми методами с применением пакета прикладной программы «BIOSTAT» и программы статистического анализа Microsoft Excel, версия XP. Исследуемые параметры приведены в виде средних величин со стандартным отклонением М ± SD, где M – среднее значение, SD – среднее квадратичное отклонение. Статистическую значимость различий оценивали по критерию Манна-Уитни. Изменения считались статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Известно, что при повреждении тканей возникает тесное взаимодействие между отдельными лейкоцитами, тромбоцитами и эндотелием сосудов [8, 10]. Высвобождающиеся из активированных и поврежденных эндотелиальных клеток биологически активные вещества способны стимулировать адгезивную и агрегационную функцию тромбоцитов. Не остаются безучастными лейкоциты, которые способны адгезировать и образовывать лейкоцитарно-тромбоцитарных агрегатов[3, 8, 9].
Лейкоциты также могут образовывать розетки друг с другом и с эритроцитами [5]. В физиологических условиях в кровотоке в небольших количествах происходит формирование разнообразных агрегатов клеток крови лимфоцитарно-тромбоцитарных (ЛТА), эритроцитарно-тромбоцитраных (ЭТА) и лейкоцитарно-эритроцитарных (ЛЭА). Физиологический смысл в формировании розеток состоит в том, что с одной стороны, микроагрегаты форменных элементов передают определенный гемостатический потенциал организму, а с другой стороны, вероятно, в агрегатах происходит взаимоактивация клеток и усиление их физиологических функций. Совершено иная картина развивается при массивном образовании розеток в патологии. Количество появляющихся лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов при стенокардии, по сравнению с нормой, увеличивается в 12 раз, а при остром инфаркте миокарда в 26 раз. В десятки раз может возрастать содержание агрегатов при неотложных состояниях [5]. Безусловно, при этом происходит блок микроциркуляции, так как крупные агрегаты не способны проходить через капилляры и нарушают микроциркуляцию. Особенно патофизиологичны лейкоцитарные агрегаты, так как клетки активируются с выделением агрессивных лизосомальных ферментов. Поскольку предпочтительным местом образования этих агрегатов является венозное русло, то основными «органами-мишенями» являются легкие, печень, сердце. Поэтому, понятен наш интерес к изучению влияния пептидов из печени и сердца на формирование ЛТА, ЭТА и ЛЭА.
Нами установлено (табл. 1), что пептиды, выделенные из тканей печени интактных и опытных животных, увеличивают ЛТА (р1 < 0,01). Следует подчеркнуть, что пептиды опытных животных в большей степени увеличивают количество ЛТА, ЭТА и ЛЭА (р1 < 0,05).
Аналогичные результаты получены при исследовании пептидов сердца экспериментальных животных (табл. 2).
Оказалось, что пептиды, выделенные из сердца интактных животных (см. табл. 2), увеличивают количество ЛТА (р1 < 0,01), ЭТА (р1 < 0,05) и ЛЭА (р1 < 0,01) и этот эффект значительно усиливается при добавлении пептидов, выделенных из сердца животных, перенесших острую кровопотерю.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу способности пептидов, особенно животных перенесших острую кровопотерю, усиливать синтез и экспрессию адгезивных молекул на мембранах форменных элементов крови, что проявляется в увеличении количества розеток. В целом, такую реакцию следует признать адаптивной, повышающей общую резистентность организма, так как в агрегатах идет взаимоактивация клеток, вследствие чего повышается их функциональная активность.
Таблица 1
Влияние пептидов из печени животных на ЛТА, ЭТА и ЛЭА (M ± SD)
|
Изучаемый показатель (число агрегатов на 100 кл) |
Кровь доноров |
||
|
Физиологический раствор (контроль) n = 15 |
Контрольные пептиды (опыт I) n = 15 |
Опытные пептиды(опыт II) n = 15 |
|
|
Лимфоцитарно-тромбоцитарные агрегаты |
10,57 ± 1,9 |
15,0 ± 1,41 р1 < 0,01* |
16,29 ± 1,11 р1 < 0,01* р2 < 0,05 |
|
Эритроцитарно-тромбоцитарные агрегаты |
1,71 ± 0,76 |
2,29 ± 0,49 р1 < 0,05 |
4,39 ± 0,38 р1 < 0,05 р2 < 0,05 |
|
Лейкоцитарно-эритроцитарные агрегаты |
1,57 ± 0,53 |
3,86 ± 1,07 р1 < 0,05 |
4,86 ± 0,69 р1 < 0,05 р2 < 0,05 |
Примечания: р1 – уровень значимости различий показателей между контролем и опытом I, между контролем и опытом II;
р2 – уровень значимости различий показателей между опытом I и опытом II;
* – значимые отличия.
Таблица 2
Влияние пептидов из сердца животных на ЛТА, ЭТА и ЛЭА (M ± SD)
|
Изучаемый показатель (число агрегатов на 100 кл) |
Кровь доноров |
||
|
Физиологический раствор (контроль) n = 15 |
Контрольные пептиды (опыт I) n = 15 |
Опытные пептиды (опыт II) n = 15 |
|
|
Лимфоцитарно-тромбоцитарные агрегаты |
10,57 ± 1,9 |
14,29 ± 1,8 р1 < 0,01* |
19,14 ± 2,34 р1 < 0,01* р2 < 0,05* |
|
Эритроцитарно-тромбоцитарные агрегаты |
1,71 ± 0,76 |
2,19 ± 0,49 р1 < 0,05* |
8,29 ± 0,39 р1 < 0,05* р2 < 0,05* |
|
Лейкоцитарно-эритроцитарные агрегаты |
1,57 ± 0,53 |
5,86 ± 1,07 р1 < 0,01* |
10,29 ± 1,49 р1 < 0,05* р2 < 0,01* |
Примечание: условные обозначения те же, что и в табл. 1
Выводы
1. Цитомедины, полученные из печени и сердца интактных и, в большей степени, перенесших кровопотерю животных, увеличивают лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию.
2. Пептиды из печени животных, подвергшихся кровопусканию, повышают число лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов.