Диагностика гематогенного распространения эпителиальных опухолей на ранних стадиях – одна из главных проблем современной онкологии. В клинической практике пока не найдено рутинных методов обнаружения микрометастазов. Морфологически единичные разрозненные опухолевые клетки не определяются – требуется применение высокочувствительных иммунологических методов. Накапливаются данные о том, что количественное определение и характеристика диссеминированных опухолевых клеток позволяет получить важную прогностическую информацию и проводить мониторинг эффективности терапии. Для того чтобы контролировать эффективность воздействия лекарственных средств на микрометастазы нужно, в первую очередь, стандартизировать методы количественной оценки единичных диссеминированных опухолевых клеток.
Целью настоящей работы явилось установление степени гематогенной диссеминации у больных раком молочной железы (РМЖ) на основании обнаружения диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител к эпителиальным антигенам.
Материалы и методы исследования. В работе использованы материалы клинического, морфологического, иммуноцитологического обследования 38 больных РМЖ, находящихся на лечении в ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер г. Ульяновска с ноября 2011 г. по настоящее время. В исследуемую группы вошли женщины в возрасте от 33 до 74 лет. Средний возраст составил 56 ± 10,0 лет. На момент постановки первичного диагноза пациентки распределились по стадиям следующим образом: I стадия была диагностирована у 3 (7,9 %) больных, IIА – у 11 (29,0 %), IIВ – у 3 (7,9 %), IIIА – у 7 (18,4 %), IIIВ – у 3 (7,9 %), IIIC – у 6 (15,8 %) и IV – у 5 (13,1 %) пациенток. Наиболее частым гистологическим вариантом был инфильтративный смешанный рак (42,9 %). Отмечена достаточно высокая частота инфильтративного протокового рака (28,6 %). Реже встречались инфильтративный дольковый рак (21,4 %) и другие формы рака (медуллярный, папиллярный, тубулярный) – 7,1 %. Больным было проведено стандартное клиническое обследование. Исследование костного мозга до начала лечения выполнялось как стандартными цитологическим и гистологическим методами, так и методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител к цитокератинам EpCAM (CD326). Материал для цитологического исследования и проточной цитометрии получали с помощью стернальной пункции. Объем костномозгового пунктата не превышал 0,5 мл, т.к. при большем объеме возможно разбавление образца периферической кровью. Проточная цитометрия проводилась на базе лаборатории иммунологии гемопоэза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН (руководитель – д.м.н., проф. Н.Н. Тупицын). Исследование проводилось в координатах CD45/CD326. Предварительно было проведено иммуномагнитное обогащение клеток, связывающих антитела CD326 (EpCAM). Это позволило оценивать до 50 млн миелокариоцитов у одного больного. Для сравнения, иммуноцитологически на цитоцентрифужных препаратах можно оценить обычно 1–2 млн. миелокариоцитов. Подсчет клеточности костного мозга и анализ миелограмм производился в клинической лаборатории. Для гистологического исследования выполнялась трепанбиопсия задне-верхней ости подвздошной кости с двух сторон.
Результаты исследования. При стандартном цитологическом исследовании метастазы в костный мозг были выявлены у 1 (2,6 %) из 38 больных. Это пациентка, у которой IV клиническая стадия была установлена до обнаружения метастатических клеток в костном мозге (T4N3cM1, метастазы в печень, плевру). При гистологическом исследовании трепанобиоптатов подвздошной кости у данной больной было выявлено двухстороннее поражение костного мозга. В другом случае исходная стадия заболевания была расценена как IIIC (T4N3aM0), после гистологического обнаружения метастазов в костный мозг было проведено рестадирование – стадия была изменена на IV. При дополнительной остеосцинтиграфии у этой пациентки были выявлены множественные остеопластические метастазы в кости, не подтвержденные рентгенологически. У обеих пациенток метастазы в костный мозг подтверждены с помощью метода проточной цитометрии. Кроме того, у 8 из 38 больных в трепанобиоптатах были обнаружены единичные плазматические клетки или микроочаговое их скопление, что является косвенным признаком поражения костного мозга. При проточной цитометрии у 2 из этих 8 пациенток были обнаружены микрометастазы.
Единичные эпителиальные (опухолевые) клетки в образцах костного мозга были выявлены у 35 (92,1 %) из 38 пациенток с помощью проточной цитометрии с применением моноклональных антител ЕрСАМ (CD326). Важно то, что количество опухолевых клеток, определяемых иммуноцитологически, было очень низким и в 77,1 % случаев составило менее 1 клетки на 1 млн миелокариоцитов. Лишь у 8 (22,9 %) из 35 больных было выявлено от 1 до 10 (в одном случае − 44) эпителиальных клеток на 1 млн миелокариоцитов. У 1 из 8 пациенток была диагностирована I стадия заболевания, у трех пациенток – IIA стадия. У остальных четырех пациенток была установлена IV стадия РМЖ (T4N3сM1), при этом у двух из них было выявлено метастатическое поражение костного мозга в трепанобиоптатах.
Если считать положительной реакцию при наличии 1 метастатической клетки среди 1 миллиона мононуклеарных клеток (МНК) костного мозга (сумма количества лимфоцитов, моноцитов и плазматических клеток), то число таких пациенток составило 31 (88,6 %) из 35. При этом только у 4 (11,4 %) из 35 больных число клеток было ≥ 10. У трех больных было выявлено наибольшее число клеток на 1 млн. МНК – 32, 35 и 330, соответственно. Четкий кластер опухолевых клеток – микрометастаз – при проведении проточной цитометрии был диагностирован у 4 (10,5 %) из 38 пациенток. При этом в 3 из 4 случаев число клеток в образцах костного мозга было очень низким и составило менее 1 клетки на 1 млн миелокариоцитов. Таким образом, метод проточной цитометрии в сочетании с иммуномагнитным обогащением популяции опухолевых клеток позволил диагностировать микрометастазы у 11 (28,9 %) из 38 больных.
Рядом ученых было показано, что количество рецидивов рака молочной железы резко возрастает при обнаружении в костном мозге 10 или 15 изолированных опухолевых клеток. В нашем исследовании не была прослежена общая и безрецидивная выживаемость в связи с небольшим сроком от начала исследования. Выявленные изменения в миелограммах пока не показали ассоциации этих признаков с присутствием отдельных опухолевых клеток в костном мозге. Работа в данном направлении будет продолжена.
Выводы. Возможность выявления единичных опухолевых клеток в костном мозге вследствие большей чувствительности является главным преимуществом метода проточной цитометрии в диагностике диссеминированных опухолевых клеток рака молочной железы в костном мозге по сравнению с морфологическими методами исследования: в 11 (28,9 %) и 2 (5,2 %) случаях из 38, соответственно. В тоже время обнаружение малого количества опухолевых клеток сложно трактовать в тех случаях, где они не формируют четкого кластера. При наличии такого кластера микрометастазы могут быть констатированы даже при наличии менее 1 опухолевой клетки на 1 миллион миелокариоцитов. Нет четких данных о том, какова «критическая» опухолевая нагрузка костного мозга, превышение которой было бы связано с ростом частоты рецидива заболевания. Получение ответов на эти вопросы станет важным шагом на пути к индивидуализации антиметастатической терапии.