Один из антогонистов фолиевой кислоты – метотрексат (аметоптерин) способен блокировать биосинтез нуклеиновых кислот и митоз [8]. В экспериментальной биологии метотрексат (МТ) используется при тестировании клеточных штаммов на устойчивость к ядам, антиметаболитам, при отборе клеточных линий – продуцентов в клеточной биотехнологии. МТ является широко известным препаратом для лечения онкологических и аутоимммунных заболеваний [1, 3].
Имеются данные, что МТ блокирует первичный рост корней Allium cepa и на основе этого был предложен специальный тест («Allium-test») для анализа биологического действия антиметаболитов, в чаcтности, цитостатиков [7, 9]. Ингибиторное действие МТ на рост корней связано с высокой митотической активностью инициалей в зоне меристемы корневого апекса при морфогенезе тканей в корнях.
В последние годы получен ряд новых данных о молекулярных механизмах действия МТ [8], в частности, в связи с исследованием биологического действия цитостатиков и проблемой программируемой клеточной смерти клеток [1].
В данной работе приведены результаты изучения действия МТ на первичный рост корней Allium cepa и изменение микроморфологии клеток в апексе корня.
Материал и методы исследования
1. Объект исследования. Эксперименты проводились на луковицах Allium cepa первого года развития (сорт Штутгартен ризен) в водной культуре. Для измерения роста корней, ежедневно прирост корней регистрировался цифровым фотоаппаратом. Длина корней измерялась на фотографиях при помощи программы PhotoM (вер. 1.21). Статиститческая обработка результатов проводилась при помощи программы Statistica 6.0.
В опытах использовались 2 препарата метотрексата:
а) фирмы ООО «ЛЭНС-ФАРМ», г. Одинцово, Московской обл. (1,1∙10–2 М);
б) фирмы «Эбеве», Австрия (2,2∙10–2М).
2. Гистологический анализ. Образцы корешков (апекс) фиксировались в фиксаторе Карнуа. Апикальная часть корней окрашивались кислым кармином по методу Сноу, в модификации Сухаревой и Батурина [5].
«Давленные» препараты готовились по стандартной методике с использованием мацерации в 45 % уксусной кислоте. Просмотр и фотографирование препаратов проводились на инвертированном микроскопе IX-71 с цифровым аппаратом Olympus-330.
3. Оптические спектры поглощения растворов МТ измерялись на спектрофотометре Shimadzu UV-2401 PC.
4. ЯМР-спектры снимались на ЯМР-спектрометре «AVANCE 600» фирмы «BRUKER», с рабочей частотой 600,13 МГц.
Результаты исследования и их обсуждение
В течение пяти дней роста наблюдается экспоненциальное увеличение длины корней в 4–6 раз по сравнению с первым днем («нулевое время»). Скорость роста корней составляла 0,1–0,7 мм/ч. Раствор МТ в воде устойчив во времени при хранении при +4 °С, в течение не менее десяти суток, что подтверждается постоянством положения пиков в спектре поглощения: 222, 258, 303 и 371,5 нм. ЯМР-спектры растворов двух использованных препаратов МТ практически идентичны.
В табл. 1. приведены данные одного из опытов, в котором определялась минимальная действующая концентрация МТ, блокирующая первичный рост корней.
Таблица 1
Влияние разных концентраций МТ на рост корней
|
ВР* |
Контроль |
МТ |
||||
|
1 (n = 5) |
2 (n = 5) |
2,2·10–6 (n = 5) |
2,2·10–7 (n = 5) |
2,2·10–8 (n = 5) |
2,2·10–9 (n = 5) |
|
|
0 час |
13,2 ± 0,5** |
15,1 ± 0,3 |
13,7 ± 0,7 |
11,8 ± 0,2 |
14,1 ± 0,2 |
16,1 ± 0,6 |
|
Через 28,5 ч |
27,9 ± 1,7 + 2,1*** |
27,9 ± 1,4 + 1,8 |
13,5 ± 0,7 - |
14,1 ± 0,3 - |
16,9 ± 1,2 + 1,2 |
30,7 ± 1,7 + 1,9 |
|
Через 52,5 ч |
37,6 ± 1,0 + 2,8 |
34,2 ± 0,6 + 2,3 |
13,6 ± 0,3 - |
13,5 ± 0,6 - |
18,9 ± 1,4 + 1,3 |
41,3 ± 0,7 + 2,6 |
|
Через 78 ч |
52,8 ± 1,3 + 4,0 |
51,0 ± 0,6 + 3,4 |
11,6 ± 0,4 - |
13,0 ± 0,5 - |
19,5 ± 1,3 + 1,4 |
51,8 ± 0,7 + 3,2 |
Примечания: * – время от начала опыта; ** – длина корней в мм; *** – прирост корней относительно «нулевого» времени.
Видно, что минимальная действующая доза МТ на рост корней равна 2,2·10–8 М. Рост корней при концентрации 2,2·10–9 М в среде роста не отличается от нормального роста в контроле.
В серии опытов изучался вопрос об обратимости ингибирующего действия МТ на рост корней. Луковицы с растущими корнями помещались в раствор МТ на 15, 30 мин, 1 и 2 ч, затем корни трижды промывались водой и дальнейший рост проходил в воде. В другом варианте корни росли в растворе МТ в течение всего опыта. В контрольных сосудах корни росли в воде. Результаты одного из опыта этой серии приведены в табл. 2.
Таблица 2
Влияние разного времени действия МТ на рост корней (концентрация метотрексата 2,2·10–7 М, обозначения см. табл. 1)
|
ВР |
Контроль |
Метоторексат 2,2·10–7 М |
||||
|
1 |
2 |
15 мин |
30 мин |
1 ч |
2 ч |
|
|
0 ч |
6,2 ± 0,4 |
6,5 ± 0,5 |
6,6 ± 0,3 |
6,5 ± 0,3 |
7,3 ± 0,1 |
7,5 ± 0,5 |
|
24 ч |
18,1 ± 1,0 + 3,0 |
14,7 ± 2,5 + 2,7 |
12,2 ± 1,1 + 1,8 |
8,9 ± 0,2 + 1,4 |
8,3 ± 0,6 + 1,1 |
8,2 ± 0,1 + 1,1 |
|
48 ч |
34,2 ± 0,5 + 5,5 |
27,5 ± 1,9 + 4,2 |
15,0 ± 1,5 + 2,3 |
9,0 ± 0,3 + 1,4 |
9,3 ± 0,4 + 1,3 |
8,8 ± 0,5 + 1,2 |
|
72 ч |
41,2 ± 0,6 + 6,6 |
29,6 ± 1,3 + 4,5 |
17,0 ± 1,4 + 2,6 |
9,8 ± 0,5 + 1,5 |
10,0 ± 1,1 + 1,4 |
9,1 ± 1,1 + 1,2 |
|
96 ч |
51,4 ± 0,6 + 8,3 |
36,4 ± 2,0 + 5,6 |
19,7 ± 0,9 + 3,0 |
9,9 ± 0,5 + 1,5 |
11,5 ± 1,2 + 1,6 |
11,8 ± 1,4 + 1,6 |
|
120 ч |
53,8 ± 0,5 + 8,7 |
42,4 ± 0,9 + 6,5 |
21,6 ± 1,3 + 3,3 |
10,6 ± 0,4 + 1,6 |
15,6 ± 1,4 + 2,1 |
13,3 ± 0,9 + 1,8 |
|
168 ч |
51,6 ± 0,2 + 8,3 |
42,1 ± 1,8 + 6,5 |
16,9 ± 2,2 + 2,6 |
11,6 ± 0,8 + 1,8 |
19,8 ± 0,4 + 2,7 |
12,3 ± 1,2 + 1,6 |
Видно, что обработка корней МТ в течение 15 мин приводит к необратимому ингибированию роста корней. В серии опытов, где использовалась концентрация МТ 2,2·10–6 М этот эффект был выражен еще сильнее.
В ЯМР-спектре чистого МТ четко выявляются линии cо значениями 8,6; 8,2; 7,7; 6,9; 3,2 ppm и триплет линий в области 2,0–2,3 ppm. При инкубации с корнями лука в течение 2 ч практически сохраняются основные линии в спектре МТ. Однако после 24 ч инкубации в спектре пропадают линии в области 6,9–8,6 ppm, что может указывать на метаболическое разрушение исходного МТ и появление метаболитов в области 1,0–4,5 ppm.
Морфологический анализ клеток апекса корня при действии МТ показал, что при действии МТ в препаратах полностью отсутствуют клетки в состоянии митоза. Многие клетки теряют четкие границы, приобретают сморщенный вид. Аналогично ядра более плотные, имеют пикнотический вид, ядрышки не выявляются. Вообще ткань более плотная и труднее подвергается мацерации и раздавливанию. Микроморфологический анализ препаратов показал, что площадь клеток и ядер в опыте уменьшается приблизительно в два раза (табл. 3). Форма клеток практически не изменяется (отношение длины к ширине, длина измерялась вдоль колонок клеток, а ширина поперек колонок).
Таблица 3
Микрометрические параметры клеток апекса корня в контроле и при действии МТ (n – число измеренных клеток)
|
Параметры |
М ± m |
n |
М ± m |
n |
|
Контроль |
МТ |
|||
|
Длина клеток (мкм) |
29,5 ± 0,7 |
54 |
24,5 ± 0,5 |
51 |
|
Ширина клеток (мкм) |
24,4 ± 0,4 |
54 |
17,1 ± 0,4 |
51 |
|
Площадь клеток (мкм2) |
708,9 ± 21,9 |
53 |
417,5 ± 11,8 |
60 |
|
Площадь ядер (мкм2) |
261,6 ± 7,5 |
54 |
95,1 ± 2,7 |
60 |
Примечание. Попарное сравнение параметров клеток в контроле и при действии МТ: разница достоверна (Р < 0,95; критерий Стьюдента).
Цитологический анализ клеток корневого апекса после действия МТ показал сильные дегенеративные изменения в клетках в области апикальной меристемы. Ранее отмечалось, что в инициальных клетках практически полностью исчезают митозы и клетки задерживаются в стадии S клеточного цикла. Для клеток животных такие данные получены во многих работах, проведенных на целых животных или в опытах с культурой клеток [1]. Полученные нами данные представляют интерес с точки зрения представлений об апоптозе или запрограммированной смерти клеток у растений, которые в настоящее время активно развиваются [4]. Для животных представления о дегенерации опухолевых клеток по типу апоптоза под действием МТ сейчас практически не вызывают сомнения [1, 8]. Можно ли отнести полученные нами результаты как цитологическое выражение программируемой клеточной смерти меристемных клеток корневого апекса при нарушении синтеза ДНК под действием МТ? Наверное такой вывод преждевременен, хотя по всем морфологическим признаком, наблюдаемые нами дегенеративные изменения, соответствуют описаниям программируемой клеточной смерти (апоптоза) у растительных клеток [4].
Вопрос о механизме действия МТ на рост корней также требует дополнительных исследований. В настоящее время установлено, что для проявления ингибирующего действия на дигидрофолатредуктазу МТ должен превратиться в активную форму (метотрексатполиглутамат) под действием фолиополиглутаматсинтетазы [1, 8]. Для растительных клеток вопрос о такой «активации» МТ пока остается открытым.
Наконец, представляет интерес вопрос о судьбе МТ в процессе его действия на меристемные клетки в корневом апексе. Известно, что МТ, введенный в организм пациентов, метаболизируется с образованием одного из главных метаболитов – 7-гидроксиМТ, который определяется с помощью ферментного иммунноанализа и жидкостной хроматографии. С использованием ЯМР-спектроскопии нами показано, что в инкубационной среде в ходе роста корней на фоне МТ происходит выделение в среду ряда соединений, и исчезновение в ЯМР-спектрах линии в области 6,9–8,6 ppm, характерных для МТ. Эти данные показывают, что по крайней мере через 24 ч МТ разрушается в инкубационной среде, и наблюдаемое нами прекращение роста корней становится необратимым уже в первые часы действия МТ.
В настоящее время ЯМР-спектроскопия высокого разрешения активно используется при изучении метаболизма физиологически активных соединений природного происхождения [2]. Мы считаем, что использование ЯМР-спектроскопии в сочетании с прямыми биохимическими методами анализами представляется перспективным для исследования метаболизма в меристемной ткани корневого апекса под действием МТ и других антиметаболитов [6].
Концепция «аллиум-теста» для определения биологической активности цитостатиков и других антиметаболитов, сформулированная Г.Дейссоном больше полувека назад, с нашей точки зрения, сохраняет актуальность в настоящее время [7], в связи с расширением работ в области поиска новых цитостатиков для химиотерапии онкологических и аутоиммунных болезней заболеваний [1, 3]. Однако требуется модификация этого теста на основе современных данных о молекулярном действии метотрексата на клеточный цикл [8].
Основные выводы
1. МТ приводит к полной остановке роста корней лука (Allium cepa). Минимальная действующая концентрация МТ лежит в области 10–8–10–9 М.
2. Ингибирующее действие МТ проявляется уже при действии в течение первых 30 мин действия на корни (концентрация МТ 2·10–7 М) и сохраняется в течение нескольких дней после его отмывки.
3. Спектр поглощения МТ имеет 4 полосы поглощения в ультрафиолетовой области спектра (222, 258, 303 и 371,5 нм). ЯМР-спектры МТ содержат несколько пиков (8,6; 8,2; 7,7; 6,9; 3,2 ppm и триплет линий в области 2,0–2,3 ppm).
4. При инкубации с корнями в ЯМР-спектрах инкубационного раствора наблюдаются изменения, по-видимому, свидетельствующие о метаболическом разрушении МТ в процессе взаимодействия с корневой системой лука.
5. Цитологический анализ показал, что под действием МТ меристемные клетки корневого апекса претерпевают сильные дегенеративные изменения.
Работа поддержана грантом РФФИ, проект № 07-04-00510.