Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

ASSESSMENT OF SPERMATOGENOUS EPITHELIUM AND EXIT OF DOMINANT LETHAL MUTATIONS IN THE RATS AFTER ACTIVITY OF HEXAVALENT CHROMIUM IN SMALL DOSES

Mamina V.P. 1 Sheiko L.D. 2 Zhigalsky O.A. 1
1 Federal state budgetary establishment of the Science «Institute of Plant and Animal Ecology
2 Federal official body «The Ural scientific research Institute of Protection of Mother and Infancy of Federal agency on highly technological medical aid»
We have done the estimate of a condition spermatogenous epithelium, spermatozoon, embryonic losses and processes lipid peroxidation in гонадах at rats after after intraperitonealy introductions in doses 2.8, 0.28 and 0.028 mg of bichromate potassium (K2Cr2O7) /kg of mass of a body for 48 day. Chrome (Сr (V1) causes structural changes in spermatogenous epithelium, which lead to increase of pathological forms сперматозоидов and to growth embryonic losses. At the greatest dose (2.8 mg/kg) changes in reproductive function are caused by toxic properties Сr (V1), at the least dose (0.028 mg/kg) – mutagenic effect. Observed increase of lipid peroxidation is accompanied by suppression of antioxidant activity of testis.
Cr (VI)
spermatogenous epithelium
spermatozoon
embryonic losses
lipid peroxidation
rats

Соединения шестивалентного хрома относятся к опасным загрязнителям окружающей среды, которые, обладая мутагенными, канцерогенными свойствами, входят в перечень потенциально опасных химических веществ по действию на репродуктивную функцию человека [6]. Высокий уровень хрома в крови, моче и других органах обнаружен у рабочих профессионально связанных с хромом. Шестивалентный хром (Cr VI) является одним из основных факторов риска в период полового созревания организма. Данные о влияние малых доз шестивалентного хрома на мужскую половую систему единичны и противоречивы. Это, по-видимому, связано с тем, что исследования, как правило, имеют однонаправленный характер: либо изучение гистоархитектоники семенников, либо изучение морфологических показателей сперматозоидов. Встречается незначительное число работ, когда в одном исследовании проводится сравнительный анализ морфофункционального состояния семенников с различными показателями сперматозоидов, и затем прогнозируется фертильность. Для прогнозирования возможности оплодотворения были разработаны различные так называемые индексы (показатели) плодовитости (фертильности), однако, все они носят относительный и условный характер. Следует отметить, что на сегодняшний день не существует ни одного теста, который бы предсказал с высокой точностью оплодотворяющий потенциал эякулята in vivo или in vitro, за исключением глубоких нарушений, в частности азооспермии. Несмотря на усилия, предпринимаемые Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) для стандартизации исследований эякулята [5], все – таки сохраняется значительная вариация показателей спермограммы. Поэтому интегральным показателем состояния мужской генеративной функции служит оплодотворяющая способность сперматозоидов, а показателем генетических повреждений в половых клетках – метод учета доминантных летальных мутаций. Таким образом, при изучении действия химических соединений на репродуктивную функцию, особенно в малых дозах, необходим комплексный подход, т.е. помимо оценки морфофункционального состояния семенников, сперматозоидов учитывать частоту оплодотворения и выход доминантных летальных мутаций. Важным звеном в изучении механизмов повреждающего действия шестивалентного хрома на сперматогенный эпителий является определение функционального состояния клеточных мембран, которое зависит от процессов перекисного окисления липидов.

Цель исследования – провести количественный и морфологический анализ сперматогенного эпителия и сперматозоидов, провести оценку состояния перекисного окисления липидов в гонадах и выхода доминантных летальных мутаций у крыс, подвергнутых действию шестивалентного хрома (Cr VI) в малых дозах. На основании полученных результатов выявить механизмы действия шестивалентного хрома.

Материалы и методы исследования

Эксперименты были выполнены на 30 крысах-самцах с массой тела 230-260 г и 60 интактных самках линии Вистар. Моделирование хромовой интоксикации осуществлялось при субхроническом (48 дней) внутрибрюшинном введении бихромата калия (K2Cr2O7) в дозах 1/1000, 1/100 и 1/10 от ЛД50: (ЛД50 – 28 мг/кг массы тела), что составляет 0.028; 0.28; 2,8 мг/кг массы тела по веществу. Наибольшая из доз соответствует уровню порога острого действия по общетоксическим показателям, дозы 0.028 и 0.28 мг/кг в токсикологии считаются малыми дозами.

Животные были разделены на группы в соответствии с получаемой дозой: 1-я группа – 0.028 мг/кг, 2-я группа – 0.28 мг/кг и 3-я группа – 2.8 мг/кг. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор. В конце экспозиционного периода животных умерщвляли путем цервикальной дислокации с соблюдением требований Международных принципов Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным для экстирпации органов [9], затем были удалены семенники и хвостовая часть эпидидимиса. Определяли динамику изменения массы тела у контрольных и опытных животных, относительную массу семенников. Для цитологической оценки состояния сперматогенеза использовали мазки клеточного гомогената семенников [1].

Учитывали процентное соотношение отдельных типов сперматогенных клеток, митотический и мейотический индекс (количество митозов и мейозов на 1000 клеток, в ‰), патологические митозы (оценка 300 ана-телофаз), количество округлых сперматид с микроядрами. Сперматозоиды, извлеченные из хвостовой части эпидидимиса, подвергались количественной и морфологической оценке. Подсчет числа сперматозоидов в 1мл проводили в лейкоцитарном меланжере и камере Горяева с использованием физиологического раствора [5]. Определение процента патологических форм сперматозоидов проводили на мазках, фиксированных метиловым спиртом и окрашенных азур-эозином. Уровень перекисного окисления липидов в семенниках определяли по накоплению конъюгированных диенов [3] и малонового диальдегида [7], активность антиоксидантной системы – по подавлению Fe2+-зависимового окисления фосфолипидов желтка [2]. В конце экспозиционного периода самцов из каждой опытной и контрольной группы спаривали с девственными самками в стадии эструса (в соотношении 1:2). У самок на 19-20-й день беременности определяли: количество желтых тел в яичниках, число живых и мертвых эмбрионов. Учитывали процент беременных самок, общую эмбриональную смертность (желтые тела – живые эмбрионы/желтые тела х100) и постимплантационную гибель эмбрионов (отношение числа мертвых эмбрионов к сумме живых и мертвых эмбрионов х100) [8]. Для статистической обработки экспериментального материала использовали непараметрический тест Вилкоксона-Манна-Уитни и критерий χ2

Результаты исследования и их обсуждение

Вес животных после недельного карантина во всех группах стал примерно одинаковым (рис. 1). К концу экспозиционного периода прибавление в весе тела у животных контрольной группы составило 10 %, в первой группе – 6 %, во второй – 2 % и в третьей – 0 % (рис. 1а).

Относительный вес семенников не изменялся. Цитологический анализ препаратов семенников показал достоверно значимое (р< 0.05) снижение числа сперматоцитов во второй (0.28 мг/кг) и третье (2.8 мг/кг) группах, сперматид- во всех группах и сперматозоидов – в третье группе (рис. 1б). При всех исследуемых дозах наблюдалось снижение митотического и мейотического индексов (рис. 1в). При всех исследуемых дозах наблюдалось увеличение числа округлых сперматид с микроядрами (р< 0.05) и числа патологических форм сперматозоидов (р< 0.05), значимо возрастал процент аномальных митозов, отмечалось наличие многоядерных сперматид (рис. 1в, г; рис. 2 А, Б).

mamina1.wmf

Рис 1. Изменение веса тела, количественные и морфологические изменения сперматогенного эпителия через 48 суток после внутрибрюшинного введения бихромата калия в разных дозах: а – вес тела до введения (1), после введения (2); б – число сперматогоний (1), сперматоцитов (2), сперматид (3), сперматозоидов (4); в – число округлых сперматид с микроядрами (1), число мейозов (2), число митозов (3); г – число патологических митозов (1), число патологических сперматозоидов (2). * р <0.05 в сравнении с контролем

mamina2.tif

Рис 2. Морфологическая характеристика сперматогенных клеток (А) и сперматозоидов (Б) после воздействия бихромата калия. Окрашивание азур эозином, х 960 (А), х 600 (Б). А – аномальные митозы (АМ), микроядра в сперматидах (СМЯ), многоядерные сперматиды (МЯ). Б – нормальный сперматозоид (Н), сперматозоиды с аномальной головкой (обозначены стрелкой)

Количество эпидидимальных сперматозоидов составило при дозе 0.028 мг/кг – 37.9 тыс./мл, при 0.28 мг/кг – 36.1 тыс./мл, при 2.8 мг/кг – 35.5 тыс./мл против 46.9 тыс./мл в контроле, разница не значима. У животных во всех опытных группах значимо возрастала концентрация диеновых конъюгатов (ДГ), а у крыс 3-й группы – и содержание малонового диальдегида (МДА), наблюдается тенденция к подавлению активности антиоксидантной системы (табл. 1).

Таблица 1

Показатели перекисного окисления липидов в семенниках крыс при воздействии бихромата калия в разных дозах (М ± м). * – достоверно значимые различия при р<0,05

Показатели

нмоль/г ткани

Контроль

Доза бихромата калия

0,028 мг/кг

0,28 мг/кг

2,8 мг/кг

ДК

МДА

АОА, усл.ед.

6,950 ± 0,172

3,622 ± 0,136

0,40 ± 0,06

8,281 ± 0,868*

3,942 ± 0,566

0,28 ± 0,06

7,618 ± 0,324*

3,836 ± 0,210

0,025 ± 0,04

7,764 ± 0,280*

3,962 ± 0,224*

0,30 ± 0,03

Анализ доминантных летальных мутаций при всех исследуемых дозах показал достоверно значимое увеличение общей эмбриональной смертности, которая происходит в основном за счет постимплантационных потерь (табл. 2).

Таблица 2

Результаты доминантно-летального анализа у крыс при воздействии различных доз бихромата калия

Показатели

Группа

Контроль

1

2

3

Число беременных самок, %

Среднее число на самку:

желтых тел

живых эмбрионов

мертвых эмбрионов

Общая эмбриональная смертность, %

Доимплантационные потери, %

постимплантационные потери, %

85

12.2 ± 0.41

± 0.52

± 0.02

24.5

20.5

5.1

72

11.0 ± 0.52

6.5 ± 0.81*

1.8 ± 0.31*

37.5*

24.5

21.6.*

77

11.3 ± 0.35

± 0.85*

1.4 ± 0.22*

38.1*

25.6

16.7*

75

11.2 ± 0.33

7.1 ± 0.80*

1.2 ± 0.25*

35.5*

25.8

14.5*

*Достоверно значимые различия с контролем при р<0,05.

Уменьшение числа герминативных клеток, возможно, обусловлено как их гибелью в результате токсического действия хрома, так и блоком митозов и мейозов. Снижение числа сперматогенных клеток в семеннике приводит к падению количества эпидидимальных сперматозоидов. Увеличение числа сперматид с микроядрами и процента аномальных митозов способствует возрастанию патологических форм сперматозоидов и как следствие – снижение оплодотворяющей способности, рост эмбриональной смертности. Эмбриональные потери могут быть как до, так и после имплантации. Основным показателем мутагенного действия химических воздействий служит постимплантационная гибель [4]. При снижении вводимой дозы бихромата калия мутагенный эффект усиливается за счет того, что половые клетки не гибнут и сохраняют способность к оплодотворению.

Заключение

Анализ полученных данных позволяет заключить, что действие Cr VI даже в относительно невысоких дозах приводит к нарушению гаметогенеза. При наибольшей из исследуемых доз изменения в репродуктивнойфункции обусловлены токсическими свойствами Cr VI, а при наименьшей дозе – мутагенным эффектом. Накопление в половых клетках перекисных продуктов оказывает влияние на процессы мейоза , возможно воздействуя на ДНК клетки, тем самым вызывая в них мутационные изменения, что приводит к увеличению патологических сперматозоидов и как следствие – гибели плодов.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы научных исследований УрО РАН (№12-С-4-1012, № 12-П-4-1068).