Температура – один из экологических факторов, определяющих скорости биохимических процессов и, тем самым, регулирующих стабильность биологических структур и процессов, протекающих на молекулярном уровне.
Гипотермия находит широкое применение в медицине с целью снижения обменных процессов, приводящих к повышению устойчивости организма к воздействию многих неблагоприятных факторов [1, 2]. Наряду с этим, при гипотермии запускается ряд процессов, имеющие постгипотермические последствия. В связи с этим практическое значение имеет поиск средств, защищающих организм от этого патологического воздействия.
Известно, что важную роль в сдерживании стресс – индуцированных свободнорадикальных процессов играют эндогенные регуляторные пептиды и их синтетические аналоги, в частности, опиоидный гексапептид даларгин [11]. По данным литературы, даларгин обладает множеством биологических эффектов, в том числе и мембраностабилизирующим при гипотермии [3].
Целью данного исследования явилось определение структурных параметров мембран эритроцитов при гипотермии разной глубины и возможная коррекция обнаруженных изменений путем введения препарата даларгина.
Материалы и методы исследования
Эксперименты проводились на беспородных белых крысах, содержащихся в обычных условиях вивария.
Гипотермию крыс вызывали в холодовых камерах, в рубашке которых циркулировала вода с температурой 4-5 ºС. Температуру тела снижали до 30 ºС (умеренная гипотермия) и 20 ºС (глубокая гипотермия).
За 30 мин до декапитации (контроль) или за 30 мин до начала снижения температуры тела животным внутрибрюшинно вводили 0,5 мл препарата даларгина в дозе 100 мкг/кг массы.
Кровь центрифугировали для получения эритроцитов при 2000 об/мин в течение 10 мин.
Структурное состояние мембран эритроцитов определяли с помощью флуоресцентного зонда пирена [4, 5]. Микровязкость липидной фазы определяли методом латеральной диффузии зонда пирена в суспензии эритроцитов.
Суспензию эритроцитов (0,5 мг белка/мл) инкубировали 1 мин со спиртовым раствором пирена, конечная концентрация которого 8 мкМ. Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофотометре Hitachi (Япония). Коэффициент эксимеризации пирена Fэ/Fm, равный отношению интенсивности флуоресценции эксимеров Fэ и мономеров пирена Fm, находится в обратной зависимости от скорости латеральной диффузии зонда в липидном слое мембран. В вязкой среде степень эксимеризации пирена снижается, поэтому коэффициент эксимеризации находится в обратной зависимости от величины относительной микровязкости [4]. Микровязкость липидного бислоя эритроцитратных мембран оценивали при длине волны возбуждения 334 нм. Максимум длин волн флуоресценции составляли для мономеров пирена 393 нм, для эксимеров 470 нм.
Микровязкость белкового окружения определяли по соотношению флуоресценции эксимера (Fэ) и мономера (Fm) пирена при длине волны возбуждения 282 нм. В основе метода лежит индуктивно-резонансный перенос энергии с ароматических остатков белка на пирен в пределах расстояния, называемого радиусом Фёрстера [4]. Отличием данного метода от предыдущего является лишь иная длина волны поглощаемого света.
Эффективность переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых остатков мембранных белков на пирен оценивали по тушению флуоресценции суспензии эритроцитов при длине волны возбуждения 282 нм и длине волны флуоресценции 330 нм в отсутствии пирена и после инкубации с зондом. Эффективность переноса энергии определяли по выражению:
(F0 – F)/F0,
где F0 – интенсивность флуоресценции эритроцитов в отсутствии пирена; F – интенсивность флуоресценции суспензии эритроцитов после инкубации с пиреном.
Результаты исследования и их обсуждение
Исследование структурных свойств мембран эритроцитов с помощью флуоресцентного зонда пирена показало, что коэффициент эксимеризации пирена Fэ/Fm (334) имеет лишь слабую тенденцию к снижению по сравнению с контролем при исследованных нами уровнях гипотермии (табл. 1). По-видимому, это свидетельствует о том, что липидная фаза мембран, в которой растворены молекулы зонда, сама по себе не претерпевает существенных изменений при гипотермии.
Как видно из табл. 1, предварительное введение даларгина охлажденным животным также существенно не влияет на величину коэффициента эксимеризации пирена.
Таблица 1
Структурные параметры мембран эритроцитов при гипотермии и на фоне введения даларгина (М±m; n = 6-8)
|
№ |
Состояние животного |
Fэ/Fm (334) |
Fэ/Fm (282) |
Величина (F0 – F)/F0 |
|
1 |
Контроль |
0,63±0,01 |
0,94±0,05 |
0,135±0,010 |
|
2 |
Контроль + даларгин |
0,55±0,02 |
1,24±0,04 |
0,094±0,0007 Р1-2<0,05 |
|
3 |
Гипотермия 30 °С |
0,56±0,02 |
1,24±0,06 |
0,094±0,010 Р2-3<0,02 |
|
4 |
Гипотермия 30 °С + даларгин |
0,57±0,03 |
1,20±0,04 |
0,107±0,010 |
|
5 |
Гипотермия 20 °С |
0,62±0,01 |
1,41±0,06 |
0,155±0,008 |
|
6 |
Гипотермия 20 °С + даларгин |
0,57±0,05 |
1,21±0,04 |
0,109±0,01 Р5-6<0,01 |
Таким образом, относительная микровязкость липидного бислоя эритроцитарных мембран крыс в условиях снижения температуры тела и при гипотермии с предварительным введением даларгина остается в пределах нормы.
В то же время при гипотермии изменяется другой параметр – коэффициент эксимеризации пирена Fэ/Fm (282). При этом, чем глубже гипотермия, тем выше эксимеризация зонда. Так, коэффициент эксимеразации пирена при гипотермия 30 °С повышен на 32 %, а при гипотермия 20 °С – на 50 %.
Поскольку коэффициент эксимеризации пирена Fэ/Fm (282) характеризует текучесть аннулярных липидов [4, 5], то полученные нами результаты указывают на зависимое от температуры тела снижение микровязкости зон белок-липидных контактов, или повышение текучести аннулярных липидов.
Введение даларгина интактным животным приводит к повышению параметра Fэ/Fm (282) на 32 %, который остаётся на этом же уровне и при гипотермии.
Таким образом, на фоне даларгина гипотермия не оказывает влияния на микровязкость зон белок-липидных контактов.
Исследование интенсивности безизлучательного переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых остатков мембранных белков на пирен при гипотермии 30 °С выявило снижение эффективности переноса энергии (F0 – F)/F0 с белков на пирен на 32 %, что может быть следствием структурных перестроек в мембранных белках эритроцитов. Такие структурные перестройки мембранных белков могут быть, по крайней мере, следствием двух причин [6]:
1) ассоциация или олигомеризация интегральных белков, вследствие повышенной генерации активных форм кислорода (АФК) и накопления поперечно-сшивающих продуктов ПОЛ типа МДА;
2) снижение степени погружения белков в липидный бислой.
В соответствии с этим можно предположить, что при гипотермии 30 °С уменьшается степень погруженности мембранных белков с липидный бислой. Уменьшение погруженности белков в липидный бислой при гипотермии 30 °С может быть связано с появлением на поверхности белков гидроперекисных группировок под действием АФК [7, 8]. В то же время АФК и поперечно-сшивающие продукты ПОЛ, избыточно образующиеся в крови при гипотермии, могут приводить к олигомеризации мембранных белков. При глубокой гипотермии, в отличие от умеренной, эффективность переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых осадков мембранных белков на пирен возрастает.
Эти результаты свидетельствуют, с одной стороны, о том, что при глубокой гипотермии увеличивается степень погружения мембранных белков в липидный бислой, с другой стороны – о фрагментации мембранных белков либо в результате спонтанной фрагментации окислительно-модифицированных белков [9], либо за счет активации эндогенных протеиназ. Установлено, что окислительно модифицированные белки легче и быстрее гидролизуются специфическими протеиназами [10].
Как видно по табл. 1, введение даларгина контрольным животным снижает эффективность переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых остатков мембранных белков на пирен. Такое действие даларгин оказывает и в условиях гипотермии.
Известно, что даларгин предотвращает активацию свободнорадикальных процессов при низкотемпературном стрессе [11]. С.П.Львова с соавт. [3] показала, что введение даларгина существенно снижает накопление продуктов перекисного окисления липидов в тканях, как в норме, так и при гипотермии. Установлено, что даларгин также снижает интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови у интактных и охлажденных до 30 и 200С животных [12]. Учитывая эти результаты можно предположить, что снижение эффективности переноса энергии электронного возбуждения с мембранных белков эритроцитов на пирен может быть связано со снижением окислительной модификации мембранных белков эритроцитов при введении даларгина.
Таким образом, при гипотермии наблюдаются изменения структурной организации мембран эритроцитов крыс, которые проявляются в увеличении текучести аннулярных липидов, при сохранении близкой к контролю микровязкости липидного бислоя, появлению структурных перестроек в мембранных белках.
Действие даларгина на интактных и гипотермических крыс характеризуется снижением микровязкости зон белок-липидных контактов, уменьшением эффективности переноса энергии электронного возбуждения с мембранных белков на пирен.
Выводы
1. Исследование структурных параметров мембран эритроцитов не выявило влияния гипотермии на относительную микровязкость «общей липидной фазы» мембраны.
2. Низкая температура тела, независимо от уровня гипотермии, снижает микровязкость зон белок – липидных контактов мембран эритроцитов. В зависимости от температуры тела изменяется погруженность белков в липидный бислой мембраны.
3. Защитный эффект гипотермии зависит от глубины гипотермии. При глубокой гипотермии даларгин существенно не предотвращает изменение структурно – функциональных параметров мембран эритроцитов.