Работа является фрагментом плановых научно-исследовательских работ ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова Национальной академии медицинских наук Украини» «Применение єлектромагнитных полей (ЭМП) для усиления образования некоторых метаболитов и повышения стабильности биологических свойств их продуцентов» отраслевой шифр АМН 74/2007, № госрегистрации 0107U001639 (отмечена дипломом Президиума НАМН Украини, как лучшая, выполненная в 2009 г.) и «Иммунобиологическая характеристика отдельных фракций дифтерийного, столбнячного анатоксинов и определение режимов модификаций екзотоксинов физико-химическими методами»отраслевой шифр АМН 92/2009, № госрегистрации 0110U001414.
Одной из приоритетных задач современной микробиологии являются вопросы целенаправленного воздействия определенными факторами (физическими, химическими, др.) на бактерии с целью модификации их биологических свойств, что открывает возможности влиять на ослабление патогенного потенциала эпидемически значимых инфекций, таких, как дифтерия [2, 5].
Известно, что ключевым механизмом колонизации микроорганизмами слизистых оболочек является адгезия [4]. Роль адгезинов у грамм-положительных бактерий выполняют поверхностные белки клеточных стенок, липополисахариды, тейхоевые кислоты, а возбудители дифтерии в качестве адгезинов используют также фимбрии [6]. Микробные адгезины обеспечивают специфическую адгезию, образуя лиганд-рецепторные взаимодействия с соответствующими клетками хозяина – сайты связи на цитолемме эукариотических клеток. Интенсивность лиганд-рецепторных взаимодействий между прокариотическими и эукариотическими клетками существенно зависит от электростатических сил между ними, которые обеспечивают механизм неспецифической адгезии [10].
Из литературных источников известно, что воздействие некоторых абиотических факторов может вызывать определенные адаптивные изменения биологических свойств бактерий, но влияние именно физических факторов на живые микроорганизмы изучено еще недостаточно. Особого внимания заслуживают ультразвуковые и низкоинтенсивные электромагнитные волны [3, 8, 9]. Под воздействием ультразвука (УЗ) может возникать в колоидных растворах и суспензиях электрический вибропотенциал Дебая, что приводит к изменению концентрации ионов как внутри клеток, так и на поверхности. Кроме того, возникающие процессы кавитации способствуют диссоциации молекул воды, образуя свободные активные радикалы, что лежит в основе применения УЗ для ускорения химико-технологических процессов [1]. В результате вышеописанных реакций инициализируются химические процессы, которые могут приводить к разрыву химических связей макромолекул, что в свою очередь способствует разнообразным биологическим эффектам, в том числе и к изменению адгезивной активности прокариотических клеток. Однако возможность влияния УЗ на активность колонизации патогенних бактерий изучена недостаточно. Электромагнитные поля могут при этом изменять эффекты ультразвукового влияния на биообъекты в ту или другую сторону, изменяя уровень электростатических сил и направленность электромагнитного поля [3, 8 ].
Цель работы: определить влияние ультразвука и электромагнитных волн миллиметрового диапазона на колонизационные свойства возбудителей дифтерии.
Материалы и методы исследования
Адгезивную активность до и после воздействия ультразвукових и миллиметровых волн определяли у 19 музейных и 21 циркулирующих штаммов патогенних коринебактерий.
Изучение адгезивных свойств микроорганизмов проводили по методике В.И. Бриллиса с соавторами [7]. Активность адгезивного процесса оценивали по среднему показателю адгезии (СПА), коеффициенту адгезии (КА) и индексу адгезивности микроорганизмов (ИАМ). Микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ ≤ 1,75; низкоадгезивными – от 1,76 до 2,5; среднеадгезивными – от 2,51 до 4,0, и высокоадгезивными при ИАМ более 4,0.
Для облучения микроорганизмов электромагнитным полем в узких полосах частот (квазигармонический сигнал) КВЧ-диапазона использовались генераторы сигналов Г4-141 (37,5–53,57) ГГц и Г4-142 (53,57−78,33) ГГц при их средней мощности излучения Рср ≤ 5 мВт, нагруженные на согласованные рупорные антенны, имеющие на выходе площадь раскрыва (апертуру) S ≈ 40 см2.
В качестве источника ультразвуковых излучений использован низкочастотный генератор сигналов Г3-109, нагруженный на кольцевой пьезокерамический преобразователь-излучатель типа ЦТС, работающий на частоте 60 кГц. Все использованные в опытах приборы были предоставлены Институтом радиофизики и электроники им. А. Я. Усикова НАН Украины.
Суспензию микроорганизмов готовили в соответствии с оптическим стандартом мутности 1,0 единиц по шкале McFarland с помощью прибора Densi-La-Meter (PLIVA-Lachema, Чехия), синхронизацию культур проводили действием низкой температуры (–6 °С). На тест-культуры воздействовали ультразвуком в течение от 1 до 7 часов, облучение электромагнитными волнами продолжалось 1 час до действия УЗ или 1 час после с частотами 42,2 ГГц или 61,0 ГГц.
Режимы воздействия физических факторов на коринебактерии были следующие:
Воздействие отдельно ультразвуком с частотой 60 кГц от 1 часа до 7 часов непрерывно;
Облучение отдельно сверхвысокочастотными волнами (СВЧ-волны) миллиметрового диапазона с частотой 42,2 ГГц или 61,0 ГГц в течение 1 часа;
Облучение миллиметровыми волнами с частотой 42,2 ГГц в течение 1-го часа с последующим воздействием ультразвуком частоты 60 кГц от 1 часа до 7 часов (СВЧ-волны 42,2 ГГц + УЗ);
Облучение ультразвуком з частотою 60 кГц от 1 часа до 7 часов с последующим облучением миллиметровыми волнами с частотой 42,2 ГГц в течение 1-го часа после каждого времени действия УЗ (УЗ + СВЧ-волны 42,2 ГГц);
Облучение милиметровыми волнами с частотой 61,0 ГГц в течение 1-го часа с последующим воздействием ультразвуком частоты 60 кГц от 1 часа до 7 часов (СВЧ-волны 61,0 ГГц + УЗ);
Облучение ультразвуком частоты 60 кГц от 1 часа до 7 часов с последующим облучением миллиметровыми волнами с частотой 61,0 ГГц в течение 1-го часа после каждого времени действия УЗ (УЗ + СВЧ-волны 61,0 ГГц).
Контролем культур были клеточные суспензии коринебактерий, не подвергшиеся воздействию физических факторов.
Результаты исследования и их обсуждение
При изучении показателей адгезии исходных штаммов коринебактерий отмечено, что большинство (70 %) циркулирующих культур были высокоадгезивны (ИАМ≥4), 30 % – среднеадгезивны (ИАМ от 2,51 до 4,0). Низкоадгезивных патогенов виявлено не было. Музейные штаммы были менее активными и обладали среднеадгезивные свойствами (ИАМ 3,08 – 3,41). В среднем циркулирующие штаммы характеризувались следующими показателями адгезивного процесса: СПА (4,08±0,15), КА (84,26±0,9), ИАМ (4,78±0,16); а музейные: СПА (2,64±0,12), КА (73,65±0,95), ИАМ (3,25±0,17).
В процессе экспериментов по изучению отдельного влияния УЗ установлено, что после воздействия ультразвукового поля адгезивная активность уменьшалась как у музейных, так и у циркулирующих штаммов коринебактерий. При проведении кореляционного анализа установлена практически линейная обратная зависимость адгезивной активности коринебактерий от продолжительности действия на бактерии ультразвука (r = -0,98 для СПА та r = -0,99 для показателей КА и ИАМ). Таким образом, експериментально доказано, что влияние УЗ приводило к снижению всех показателей адгезивного процесса, причем степень угнетения адгезивного потенциала прямо пропорционально зависела от времени воздействия УЗ на бактерии (рис.1, 2).
Рис. 1. Средние показатели КА (музейных и циркулирующих штаммов коринебактерий) в зависимости от времени воздействия ультразвука
Рис. 2. Средние показатели СПА и ИАМ (музейных и циркулирующих штаммов коринебактерий) в зависимости от времени воздействия ультразвука
При выборе следующего направления исследований руководствовались тем, что действие миллиметровых волн может, в первую очередь, повлиять на электростатические силы системы «патогенный агент – клетка хозяина». Допускалась также и возможность изменения концентрации самих адгезинов на поверхности взятых в опыты бактерий после их облучения в различных частотных диапазонах. Предшествующие исследования показали адаптированную реакцию тест-культур на действие миллиметровых волн двух диапазонов – 42,2 ГГц и 61,0 ГГц Именно этот спект был применен в настоящей работе.
Облучение исследуемых штаммов в частотном диапазоне 42,2 ГГц привело к выраженному снижению адгезивных свойств у представителей патогенних коринебактерий. Так, среднее количество прикрепленных к одному эритроциту бактерий (СПА) снизилось по сравнению с контрольними (необлученными) культурами у музейних штаммов в 1,7 раза (р<0,01), КА – на 28,95±1,1 % (р<0,05); а в случае циркулирующих штаммов – соответственно в 1,8 раза (р<0,01) и в 1,6 раза. Миллиметровые волны с частотой 61,0 ГГц вызывали у облученных культур коринебактерий противоположный эффект, характеризующийся повышением показателей адгезивной активности как у музейних, так и у циркулирующих тест-штаммов: музейные представители возбудителей дифтерии повышали СПА в 1,6 раза (p<0,05), КА в 1,2 раза (p<0,05), а циркулирующие в 1,7 раза (p<0,001) и в 1,05 раза соответственно.
Приведенные результаты эксперимента демонстрируют зависимость адгезивной активности исследуемых культур от диапазона облучения. Выявленные разнонаправленные еффекты влияния электромагнитных волн миллиметрового диапазона на изменение адгезивности патогенних коринебактерий свойственны в одинаковой степени всем исследуемым тест-культурам независимо от видовой принадлежности. Возможно, электромагнитное поле способствует возбуждению електронной энергии атомов и молекул, что может приводить к изменению реакционных возможностей некоторых участков биомолекул микроорганизмов, обеспечивающих колонизацию.
Совместное влияние на микроорганизмы нескольких физических факторов изучали путем их последовательного применения непосредственно друг за другом. В ходе опытов установлено, что эффекты комплексного воздействия на патогенные коринебактерии мало зависели от первоочередности применения ультразвуковых и электромагнитных волн, а в большей степени зависели от времени действия УЗ и частоты СВЧ-волн.
Показатели адгезивной активности, как музейних, так и циркулирующих тест-штаммов С.diphtheriae, после первоочередного воздействия милиметровых волн с частотой 42,2 ГГц с последующим действием УЗ в течение 4 – 7 часов уменьшались по сравнению с контролем, в среднем, в 1,07 – 2,2 раза (p<0,05), в зависимости от времени действия УЗ. При первоочередном применении УЗ с последующим облучением патогенов СВЧ-волнами 42,2 ГГц наблюдалась идентичная тенденция к снижению всех показателей адгезивного процесса.
Комбинированное (последовательное) облучение СВЧ-волнами с частотой 61,0 ГГц с дальнейшим воздействием УЗ в течение 1-3 часа стимулировало способность к адгезии у циркулирующих возбудителей дифтерийной инфекции (СПА в 1,4 раза, ИАМ в 1,22 раза (р≤0,05), а также повышало показатель КА музейних культур (на 12,9 % (р<0,01). Достоверное снижение показателей адгезивного процесса после данного режима воздействия наблюдалось только при действии УЗ более 4-х часов. При первоочередном облучении бактерий ультразвуком от 1 до 3-х часов с последующим воздействием СВЧ-волнами частотой 61,0 ГГц все показатели адгезии музейних и циркулируюших тест-штаммов превышали исходные значения. При этом, у циркулирующих штаммов патогенных коринебактерий показатели СПА и ИАМ возростали в 1,25 – 1,6 раза (p<0,01) по отношению к значениям контрольных образцов, в то время как у музейных – в 1,03 – 1,43 раза (p=0,05) соответственно (таблица).
Таким образом, комплексное облучение УЗ и СВЧ-волнами с частотой 42,2 ГГц приводит к снижению адгезивных характеристик патогенных коринебактерий по сравнению с их исходными показателями, в то время как воздействие УЗ и СВЧ-волн с частотой 61,0 ГГц повышает основные показатели адгезии при условии непрерывного действия УЗ на микроорганизмы в течение от 1-го до 3-х часов, снижая их при более длительном влиянии ультразвука. Тем не менее, все показатели адгезии при комплексном применении физических факторов были выше, чем при облучении только УЗ.
Средние показатели адгезивности штаммов С.diphtheriae после облучения миллиметровыми волнами и ультразвуком
|
Режимы чередования физических факторов |
Продол-жительность УЗ, час |
Тест-штаммы коринебактерий дифтерии |
|||||
|
Циркулирующие штаммы |
Музейные штаммы |
||||||
|
СПА |
КА |
ИАМ |
СПА |
КА |
ИАМ |
||
|
СВЧ 42,2 ГГц + УЗ |
1-3 |
3,34±0,2 |
78,70±0,2 |
3,82±0,3 |
2,12±0,2 |
67,95±2,3 |
2,71±0,3 |
|
4-6 |
2,94±0,6* |
68,15±1,5* |
3,04±0,2* |
1,54±0,3* |
55,10±2,1* |
2,20±0,3* |
|
|
7 |
1,87±0,2* |
62,25±1,9* |
2,48±0,1* |
1,25±0,1* |
43,70±3,5* |
1,85±0,3* |
|
|
УЗ + СВЧ 42,2 ГГц |
1-3 |
3,59±0,4 |
80,50±0,6 |
4,11±0,3 |
2,39±0,2 |
69,65±1,5 |
2,92±0,3 |
|
4-6 |
2,83±0,1* |
73,01±3,8* |
3,45±0,1* |
1,79±0,2* |
61,39±2,0* |
2,25±0,2* |
|
|
7 |
2,32±0,2* |
68,20±2,7* |
2,98±0,1* |
1,48±0,3* |
54,00±2,6* |
1,91±0,2* |
|
|
СВЧ 61,0 ГГц + УЗ |
1-3 |
5,63±0,1* |
84,35±4,6 |
5,86±0,2* |
3,00±0,2 |
84,54±2,1* |
3,48±0,1 |
|
4-6 |
4,52±0,1* |
77,46±2,7 |
5,06±0,1 |
2,14±0,2 |
73,65±1,0 |
2,39±0,3* |
|
|
7 |
3,69±0,1 |
73,02±1,7* |
4,38±0,2 |
1,65±0,1* |
70,95±0,9* |
2,19±0,4* |
|
|
УЗ + СВЧ 61,0 ГГц |
1-3 |
6,55±0,1* |
85,93±0,3 |
7,17±0,1* |
3,79±0,3* |
84,58±1,6* |
4,42±0,3* |
|
4-6 |
5,42±0,5* |
82,85±4,1 |
6,07±0,3* |
2,96±0,4 |
77,24±2,6* |
3,37±0,4 |
|
|
7 |
4,54±0,6* |
75,55±1,9* |
5,10±0,5* |
2,34±0,2 |
71,55±2,3* |
2,85±0,5 |
|
|
Контроль культур |
4,08±0,1 |
84,22±0,9 |
4,78±0,3 |
2,64±0,2 |
73,65±0,9 |
3,25±0,2 |
|
Примечание. * – разница достоверна, р<0,05.
Выводы. Под влиянием УЗ адгезивная активность уменьшалась пропорционально времени воздействия фактора (в 2,0 – 2,7 раза). Облучение бактерий миллиметровыми волнами приводило к разнонаправленным эффектам – при использовании волн с частотой 42,2 ГГц адгезия снижалась, а в случае частоты 61,0 ГГц возростала почти в 2 раза. Комплексное применение физических факторов усиливает эффекты монофакторного влияния на адгезию микроорганизмов, что может быть использовано при разработке клеточных вакцин для ослабления патогенных свойств тест-штаммов. Результаты эксперимента также имеют важное значение для понимания процессов адаптации патогенных бактерий к неблагоприятным условиям, их изменчивости, изменению колонизационных свойств.