Введение
Социальная иерархия – система взаимоотношений особей в группе (или диаде), возникающая при их потребности в одних и тех же ресурсах и определяющая доступ каждого члена группы (диады) к этим ресурсам. Место особи в социальной иерархии называется социальным статусом [1].
Социальная иерархия самцов формируется путем побед и поражений при агонистических контактах между животными и может приводить к развитию стресса и депрессии у субординантных особей и закреплять агрессивное поведение доминантов. Наиболее ярко это продемонстрировано в работах Н.Н. Кудрявцевой с соавт. при исследовании закрепления опыта побед и поражений в диадах мышей [2], а также при групповом содержании крыс с одним доминирующим самцом [10].
В связи с тем, что место особей в иерархии влияет на результаты экспериментальных исследований [9], может возникать необходимость определения социального статуса животных, содержащихся в группе. Целью нашей работы было разработать методику для определения социального статуса белых лабораторных крыс.
Материалы и методы
Эксперимент проводился на белых беспородных крысах-самцах, прошедших двухнедельный карантин. Животные содержались в клетках 1291Н Eurostandart Type III H, Tecniplast, Италия по трое: одно животное в возрасте 5 месяцев массой 350-400 г и два животных 4-месячного возраста массой 200-220 г, при естественном световом дне, на стандартном корме, со свободным доступом к пище и воде (кроме дней перед тестированием социального статуса). Поведение животных исследовали с 9.00 до 12.00.
По плану эксперимента, 7 суток после формирования групп животных не беспокоили, на 8-е сутки определяли социальный статус, на 12-е сутки исследовали поведение крыс в актометре, на 14-е сутки тестировали исследование крысами незнакомого предмета, на 15-е сутки повторно определяли социальный статус.
Социальный статус определяли в условиях конкурирования за воду. У крыс за 24 часа до теста убирали поилки. После этого в кормовой короб домашней клетки по центру ставили поилку с водой и в течение 8 минут регистрировали латентное время первого подхода, число подходов к поилке, длительность консуматорного питьевого поведения. Для каждого животного регистрировали число раз, которые животное отгоняло других крыс от поилки (А), и число раз, когда отгоняли его (Б). Рассчитывали вероятность доминирующего поведения (ВДП), как ВДП=А/(А+Б). По вероятности доминирующего поведения, животных разделяли на доминантов – ВДП ≥ 0,65; субдоминантов – 0,65 > ВДП > 0,35 и субординантов – ВДП ≤ 0,35. Статистическую значимость классификации проверяли методом дискриминантного анализа [6].
Исследовательское поведение животных наблюдали в клетке 1291Н Type III H без подстила. Клетку накрывали смотровой крышкой. Перед каждым тестированием клетку протирали спиртовым раствором. Тестирование длительностью 10 минут начинали сразу после помещения животного в тестовую среду. Активность животных регистрировали актометром Multy-Varimex, Colombus Instruments, США. Инфракрасные датчики были установлены на штативе по 5 в два ряда на высоте 3 см и 14,2 см от дна клетки. Расстояние между соседними датчиками в ряду составляло 6,5 см. Число пересечений лучей датчиков нижнего ряда рассматривали как горизонтальную двигательную активность (ГДА), число пересечений лучей датчиков верхнего ряда – вертикальную двигательную активность (ВДА). Длительность реакций замирания и груминга регистрировали секундомером. По окончании тестирования подсчитывали число фекальных болюсов.
Исследование животными незнакомого предмета наблюдали в домашней клетке. На время теста животных пересаживали в аналогичную клетку на чистый подстил. Перед началом теста крыс по одной сажали в домашнюю клетку и давали адаптироваться 5 минут. Тест начинали, помещая в центр клетки флакон объемом 100 мл из белого стекла, закрытого ребристой синей крышкой и заполненный для утяжеления водой. Перед каждым тестом флакон дезодорировали спиртом. В течение 10 минут тестирования регистрировали латентное время первого подхода, длительность исследования объекта, среднюю длительность исследования за подход, длительность замирания и груминга.
Результаты представляли в виде среднего арифметического и ошибки среднего. Для множественных сравнений использованием U-критерия Манна-Уитни с корректировкой по методу FDR-контроля [7], при принятом уровне значимости 5%. Значения уровней статистической значимости отличий парных сравнений выстраивали в ряд по возрастанию. Параллельно этому ряду строили ряд критических значений уровня значимости, первым членом которого был принятый уровень значимости деленный на число сравнений (р = 0,05/3 = 0,016); вторым членом – число, в два раза большее (р = 0,033), чем первый член ряда; третьим – число, в три раза большее (р = 0,050). Статистически значимыми считали отличия, при которых уровень значимости парного сравнения был меньше уровня значимости, соответствующего по месту в ряду критических значений (рассчитанное критическое значение p указывали в нижнем индексе). Для оценки корреляции между показателя первого и второго тестирования социального статуса применяли критерий Спирмена.
Результаты
Через 7 суток после начала эксперимента среднее значение и стандартное отклонение ВДП составили 0,52±0,23, распределение ВДП соответствовало нормальному (Z = 0,776, p = 0,583, n = 24). В одной клетке из 9 крысы не контактировали друг с другом, и ВДП определить не удалось. У 4-х крыс наблюдалось ВДП ≥ 0,65 – доминанты, у 6-ти крыс – ВДП ≤ 0,36 – субординанты, у 14 крыс ВДП варьировала от 0,36 до 0,64 – субдоминанты. Методом дискриминатного анализа были построены две функции, одна со значением 8,6 и дискриминантной способностью 88,4%, другая со значением 1,1 и дискриминантной способностью 11,6%. λ-Вилкса для 2-х функций равна 0,049 (χ2 = 58,8, р < 0,001). Классификация на основе математической модели не обнаружила ошибок в первоначальной классификации, предсказательная ценность модели составила 100%.
Среднее значение ВДП доминантов было больше, чем у субдоминантов, р0,033 = 0,003 и субординантов, р0,050 = 0,008 (табл. 1).
Таблица 1
Масса тела, вероятность доминантного поведения и питьевое поведение животных с различным социальным статусом в группах по трое
|
Показатель |
Доминант (n = 4) |
Субдоминант (n = 13) |
Субординант (n = 7) |
|
Масса тела, г |
357,5±17,7 |
289,8±11,2а |
264,7±6,8а |
|
Вероятность доминантного поведения |
0,94±0,04 |
0,52±0,02а |
0,28±0,03 а,б |
|
Латентное время подхода, с |
9,8±3,7 |
39,6±13,1 |
92,9±21,6а |
|
Число подходов |
2,8±0,8 |
8,4±0,6а |
6,4±0,6а |
|
Длительность питьевого поведения, с |
422,3±21,9 |
292,3±13,8а |
239,9±37,7а |
а – отличие от значений показателя у доминанта; б – отличие от значений показателя у субдоминанта.
У субдоминантнов значение ВДП было больше, по сравнению с субординантами (р0,016 < 0,001). Латентное время первого подхода к поилке у доминантов, субдоминантов и субординантов, между группами не отличалось. Число подходов доминантных животных к поилке было меньше, чем у субдоминантов (р0,016 = 0,003) и субординантов (р0,033 = 0,007). Длительность питьевого поведения доминантов была больше по сравнению с субдоминантами (р0,016 = 0,003) и субординантами (р0,033 = 0,023).Число подходов и длительность питьевого поведения субдоминантов и субординантов не отличались (р0,050 = 0,057, р0,050 = 0,191). Масса тела доминантов была больше, чем у субдоминантов (р0,033 = 0,020) и субординантов (р0,016 = 0,008), масса тела субдоминантов и субординантов не отличалась (р0,050 = 0,088).
Тестирование поведения животных в актометре (табл. 2) не обнаружило различий ГДА и ВДА между доминантами, субдоминантами и субординантами. Поведение субординантов в клетке актометра было более эмоциональным по сравнению доминантами в виде большей длительности груминга (р0,016 = 0,008) и большего числа оставленных фекальных болюсов (р0,033 = 0,031).
Число фекальных болюсов у доминантов и субдоминантов не отличалось. Длительность груминга у субдоминантов по сравнению с доминантами была больше (р0,033 = 0,017). Средняя длительность груминга субординантов не отличалась от субдоминантов, хотя число фекальных болюсов у субординантов было больше, чем у субдоминантов (р0,016 = 0,001). Отличия длительности замирания между группами обнаружено не было.
Доминанты обнаружили большую длительность исследования незнакомого предмета за подход (табл. 3) по сравнению с субдоминантами (р0,016 = 0,013) и субординантами (р0,033 = 0,014). Общая длительность исследования предмета в группах не отличалась статистически значимо. Средняя длительность исследования незнакомого предмета за подход у субдоминантов и субординантов не отличалась (р0,050 = 0,968).
Таблица 2
Поведение животных в клетке актометра Multy-Varimex
|
Показатель |
Социальный статус |
||
|
Доминант (n = 4) |
Субдоминант (n = 13) |
Субординант (n = 7) |
|
|
Горизонтальная двигательная активность |
292,3±71,2 |
275,5±27,3 |
284,0±27,7 |
|
Вертикальная двигательная активность |
150,8±23,6 |
146,8±16,4 |
131,1±15,7 |
|
Длительность груминга, с |
41,5±8,4 |
119,5±17,2а |
131,7±22,0а |
|
Длительность замираний, с |
157,5±60,6 |
149,6±22,8 |
154,0±34,9 |
|
Число фекальных болюсов |
0,5±0,5 |
0,2±0,2 |
2,9±0,6 а,б |
а – отличие от значений показателя у доминанта; б – отличие от значений показателя у субдоминанта.
Таблица 3
Исследование животными незнакомого предмета
|
Показатель |
Социальный статус |
||
|
Доминант (n = 4) |
Субдоминант (n = 13) |
Субординант (n = 7) |
|
|
Латентное время подхода, с |
0,5±0,5 |
17,7±10,4 |
21,7±8,9а |
|
Длительность исследования, с |
147,5±41,6 |
86,7±17,5 |
84,7±12,8 |
|
Средняя длительность исследования за подход, с |
13,6±1,4 |
7,3±0,9а |
7,5±0,8а |
|
Длительность груминга, с |
195,5±81,9 |
120,8±23,8 |
134,4±31,3 |
|
Длительность замираний, с |
2,0±1,2 |
22,8±10,1 |
11,7±6,1 |
а – отличие от значений показателя у доминанта.
Латентное время первого подхода к предмету у доминантов было меньше, чем у субординантов (р0,016 = 0,010). Отличия показателя между доминантами и субдоминантами (р0,033 = 0,120), субдоминантами и субординантами (р0,050 = 0,263) не были статистически значимыми. Значения длительности груминга и замираний между группами не отличались.
При повторном тестировании социального статуса на 15-е сутки эксперимента обнаружены статистически значимые корреляции между значениями ВДП (r = 0,691, p < 0,001) и длительностью консуматорного питьевого поведения (r = 0,446, p = 0,020). Изменение социальной иерархии по значениям ВДП произошло в 3-х клетках из 8-ми. В одной клетке субдоминант стал доминантом, а доминант – субординантом. В другой, где первоначально было зарегистрировано два субдоминанта и субординант, выделился доминант из субдоминантов. В третьей клетке два доминанта перешли в статус субдоминантов. Данные повторного тестирования указывают на отсутствие абсолютной стабильности иерархии крыс в триадах.
Обсуждение
В структуре социальной иерархии крыс выделяют доминирующих α-особей, имеющих свободный доступ к пищевым, пространственным ресурсам и размножению; субдоминантных β-особей, живущими рядом с доминантами и получающих доступ к ресурсам вторыми; и субординантных ω-особей, которые подвергаются атакам со стороны α-особей, но по мере старения доминирующих крыс, могут занять их место в группе [1]. Так как социальная иерархия устанавливается в агрессивных столкновениях, для побед в которых важную роль играет масса тела, можно было ожидать, что 5-ти месячные животные с большей массой будут доминировать во всех клетках. Однако, хотя в проведенном исследовании масса тела доминантов была больше чем у субдоминантов и субординантов, масса тела и возраст крысы не были критичными для ее социального статуса. Показатели питьевого поведения животных в диадах или группах не всегда отражают их социальный статус [8]. Поэтому социальный статус крыс можно выявить, применив подход Шелдеруппа-Эббе, который предложил регистрировать агонистические контакты кур в группе в виде матрицы доминирования, отражающей социальную иерархию [4].
Известно, что доминанты имеют более низкую тревожность и реагируют на изменения в окружающей среде быстрее остальных членов группы [4]. Субординанты позже подходят к незнакомому объекту и меньше исследуют его [3]. В проведенном нами эксперименте тревожное поведение субординантов характеризовалось повышением числа фекальных болюсов – показателя пассивной реакции на аверсивную обстановку, связанного с невозможностью ее избежать и повышением длительности груминга – показателя фрустрации [5]. Субдоминанты на незнакомую обстановку реагировали только повышением длительности груминга. Эти данные подтверждают правильность классификации животных на основе показателя доминирования.
Предложенный метод определения социального статуса крыс относительно нетрудоемкий, не требует какого-либо оборудования и оперирования животных по сравнению с [9, 11], позволяет получать быстрый результат. Однако, при его применении необходимо учитывать, что водная депривация животных является стрессогенным фактором.
Заключение
Регистрация агонистических контактов у поилки и питьевое поведение самцов крыс, подвергавшихся 24 часовой питьевой депривации, в группах по трое позволяет выделить доминантов, субдоминантов и субординантов. Результаты разделения подтверждаются при тестировании исследовательского поведения животных и воспроизводятся при повторном тестировании.