Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,778

INFLUENCE NEW DOSAGE FORMS OF SUCCINIC ACID ON FREE RADICAL OXIDATION PROCESSES

Simonyan E.V.1 1 Shikova Y.V.2 1
1 South - Ural State Medical University
Выбраны оптимальные условия для получения новых лекарственных форм кислоты янтарной (суппозиториев и липосом), обладающих комплексным действием и улучшенными биофармацевтическими свойствами. Изучено влияние кислоты янтарной на процессы перекисного окисления липидов. Доказано увеличение активности каталазы и снижение концентрации продуктов ПОЛ, что свидетельствует об антиокислительной активности кислоты янтарной. В присутствии экстракта прополиса эти процессы становятся наиболее достоверно выраженными по сравнению с контрольной группой.
The optimum conditions for new dosage forms of succinic acid (suppositories and liposomes) have complex effects and improved biopharmaceutical properties. The effect of succinic acid on lipid peroxidation. Proven to increase the activity of catalase and reducing the concentration of lipid peroxidation products, indicating that the antioxidant activity of succinic acid. In the presence of propolis extract these processes become more pronounced significantly compared with the control group.
liposomes
suppositories
succinic acid
lipid peroxidation products

Введение. Одной из актуальных проблем современной медицины и фармации является создание новых лекарственных средств, обладающих комплексным действием. К числу таких препаратов относятся органические кислоты, которые обладают антистрессовым действием. Одной из таких органических кислот является кислота янтарная. Она участвует в ряде биохимических реакций энергетического, структурного и ферментного обеспечения организма. Ее широкий фармакологический спектр действия предполагает исследования по созданию новых лекарственных форм. Входящие в состав всех животных и растительных клеток организма с аэробным типом дыхания, сукцинаты способны предотвращать или устранять постгипоксические нарушения энергетического метаболизма в организме и метаболический ацидоз. При этом целесообразно использовать ее в сочетании с природными биологически – активными веществами подобного действия, в частности с экстрактом прополиса, богатым фенольными соединениями. Целью настоящего исследования явилась разработка технологии ректальной и липосомальной лекарственных форм с кислотой янтарной и экстрактом прополиса и их влияния на процессы перекисного окисления липидов.

Материалы и методы

В процессе исследований для разработки оптимального состава и технологии суппозиториев с янтарной кислотой и экстрактом прополиса было использовано 12 различных композиций, из которых наиболее полное высвобождение кислоты янтарной происходило из четырех следующих составов, приведенных в таблице 1.Для выбора оптимального состава нами были изучены следующие показатели: высвобождение кислоты янтарной, время полного растворения или температура плавления, количественное определение. Результаты представлены в таблице 2 [2].Установлено, что наиболее оптимальными свойствами обладал образец № 4. Для улучшения биофармацевтических свойств нами были приготовлены подобные образцы с различным соотношением компонентов и добавлением дополнительных вспомогательных веществ. Изменение соотношений ПЭГ приводит к ухудшению процесса высвобождения, увеличению времени полного растворения. Добавление твина 80 способствует лучшему высвобождению, а при количественном определении методом спектрофотометрии растворы получаются прозрачными, не требующими фильтрования. На основании проведенных исследований определили оптимальный состав суппозиториев:

ПЭГ 400 – 0,5; ПЭГ 1500 – 0,5; ПЭГ 4000 – 0,5; Кремофор 1,0; Твин 80 – 0,1; Вода очищенная 0,5 мл; Кислота янтарная 0,1; Экстракт прополиса – 0,4 мл [3].

Для получения липосомальной суспензии (из расчета на 10 лекарственных форм) 5 г яичного лецитина растворяли в диэтиловом эфире при постоянном перемешивании на шейкере в течение 10 минут, эфир выпаривали на роторном испарителе под вакуумом на водяной бане при 37°С до образования липидной пленки, которую затем сушили в течение 2 ч. Полученную фосфолипидную пленку гидратировали 10 мл раствора, содержащего 1 г кислоты янтарной. Полученный раствор взбалтывали в течение 1 часа на шейкере, затем добавляли 2 мл экстракта прополиса и продолжали перемешивание в течение 2 часов. Для получения малых однослойных липосом использовали экструзионный метод, продавливая дисперсии липосом через мембранные фильтры «Nuclepore» (Whatman, Великобритания) с диаметром пор 400 нм по 20 раз с применением ручного мини-экструдера (Avanti Mini-Extruder, США).

Для определения степени включения кислоты янтарной к 10 мл липосомальной формы (точная навеска) прибавляли 10 мл раствора натрия хлорида 2 М, нагревали на водяной бане в течение 10 мнут, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут до полного осаждения липосом. Надосадочную жидкость помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 10 мл 0,1 моль/л раствора натрия гидроксида, растворяли невключившуюся кислоту янтарную Объем раствора доводили до метки 0,1 моль/л раствором натрия гидроксида, хорошо перемешивали. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ – 56 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Параллельно проводили такое же определение с раствором РСО кислоты янтарной. Было установлено, что полученные липосомы характеризуются степенью включения кислоты янтарной 58,5%. Для увеличения этого показателя нами была предпринята попытка введения криопротектора. Было установлено, что максимальное включение (69,7%) наблюдается при использовании 0,2% раствора сахарозы. Для повышения стабильности и достижения максимального включения кислоты янтарной нами предложено использовать сочетание фосфолипида с холестерином. Введение холестерина повышает прочность липосомальной мембраны за счет ограничения подвижности жирнокислотных цепей фосфолипида. Установлено, что при соотношении 1:0,2 наблюдается максимальный эффект включения кислоты янтарной (около 80%).

Определение антиоксидантной активности проводили в опытах in vivo. Эксперимент проводили на беспородных лабораторных крысах обоего пола массой 190 – 280 г в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей [5].

Содержание продуктов перекисного окисления липидов определяли спектрофотометрически по методике И.А. Волчегорского с соавторами [1].

Сущность метода заключается в измерении светопоглощения диеновых коньюгатов, образующихся при переокислении и перегруппировке двойных полиненасыщенных жирных кислот. Наличие максимумов светопоглощения в области 230 – 238 нм позволяет судить о содержании гидроперекисей в липидном экстракте. Максимум светопоглощения в области 260 – 290 нм свидетельствует об окислительной деструкции липидных гидроперекисей.

Определение проводили по методике. В пробирку из химически устойчивого пластика вносили 0,5 мл гомогената ткани в изотоническом растворе, содержащем 0,1% ЭДТА или равный объем ЭДТА- стабилизированной плазмы крови (конечная концентрация ЭДТА в плазме 1 мг/мл). Добавляли 5 мл смеси гептан-изопропанол в объемном соотношении 1:1. Пробирку закрывали пластиковой пробкой, встряхивали и помешали в лабораторный шейкер на 20 минут. Полученный экстракт центрифугировали, переносили в высокие стеклянные пробирки и разбавляли 5 мл смеси гептан-изопропанол (3:7). В разбавленную липидную вытяжку вносили 2 мл раствора хлороводородной кислоты (рН = 2) и оставляли на 30 минут для полного разделения экстракта на фазы. Верхнюю (гептановую) фазу осторожно декантировали ипереносили в отдельную пробирку, избегая частичного смешивания фаз. Водноспиртовую часть липидной вытяжки освобождали от воды и растворенных в ней примесей. Для этого в освобожденный от гептановой фазы экстракт добавляли не менее 1 грамма сухого натрия хлорида. Пробирку встряхивали и оставляли на 30 минут для отстаивания водной фазы. Изопропанольную фазу декантировали, избегая ее контаминации водной фазой. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре СФ – 56 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при трех длинах волн: 220,232 и 278 нм.

Определение содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов проводили по вышеуказанной методике, используя в качестве аналитической длины волны 400 нм. Для оценки интенсивности аскорбат-индуцированного ПОЛ к изопропанольным экстрактам добавляли индуцирующую ПОЛ смесь (0,5 мМ аскорбиновой кислоты и 50 мкг сульфата железа). Через 10 минут, когда наблюдается наибольшее изменение содержания молекулярных продуктов липопероксидации, проводили их спектрофотометрическое определение.

Активность каталазы определяли по методу Королюка М.А. Для этого к к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода вносили 0,1 мл изучаемого образца. В холостую пробу вместо сыворотки вносили 0,1 мл воды очищенной и инкубировали при 370С в течение 10 минут, после чего реакцию останавливали добавлением 1 мл 4% раствора аммония молибдата. Интенсивность окраски измеряли на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которой вместо перекиси водорода вносили 2 мл воды очищенной [4].

Результаты и обсуждение

Введение исследуемых веществ проводили в течение 7 дней ректально или перорально в концентрации 100 мг/кг. Параллельно проводили такое же определение с кислотой янтарной. Расчет индексов окисления, отражающих относительный уровень первичных и вторичных продуктов ПОЛ, соответственно, проводили по отношению оптических плотностей Е232/Е220 и Е278/Е220. Относительное содержание шиффовых оснований рассчитывали по отношению поглощения при 400 нм к оптической плотности при 220 нм.

Окисляемость липидных экстрактов оценивали по соотношению величин оптических плотностей Е232/Е220, Е278/Е220, определяемых до и после внесения инициирующей ПОЛ смеси и выражали в процентах по отношению к исходному уровню

Содержание каталазы рассчитывали по формуле:

Е = (Ахол-Аоп)×V×t×K (мкат/л),

где Е – активность каталазы в мкат/л; А – оптическая плотность холостой и опытной проб; V – объем вносимой пробы, 0,1 мл; t – время инкубации, 600 сек; К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный 2,22*103 мМ-1*см-1.

Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 1

Составы суппозиторных композиций с янтарной кислотой и экстрактом прополиса

Состав № 1

ПЭГ 4000 – 1,0

Вода очищенная – 1 мл

Кремофор – 1,25

Лутрол - 0,75

Кислота янтарная – 0,1

Экстракт прополиса 10% - 0,4

Состав № 2

ПЭГ 4000 – 1,0

Вода очищенная – 1 мл

Глицерин – 0,5

Лутрол - 1,0

Кислота янтарная – 0,1

Экстракт прополиса 10% - 0,4

Состав № 3

Масло какао 2,0

Вода очищенная – 0,5 мл

Твин 80 – 0,3

Кислота янтарная – 0,1

Экстракт прополиса – 0,4

Состав № 4

ПЭГ 400 – 0,5

ПЭГ 1500 – 0,5

ПЭГ 4000 – 0,5

Кремофор 1,0

Вода очищенная 0,5

Кислота янтарная 0,1

Экстракт прополиса – 0,4

Таблица 2

Изучение фармацевтической доступности суппозиториев в опытах in vitro


состава

Высвобождение кислоты
янтарной, %

Диаметр окрашенной зоны (диффузия в агар), мм

Время полного растворения/
температура плавления

15 мин

30 мин

45 мин

60 мин

15 мин

30 мин

45 мин

60 мин

1

36,7

48,5

69,4

81,5

17

19

21

26

19 минут

2

38,4

41,7

50,9

76,5

18

20

21

23

19 минут

3

12,8

38,7

54,8

76,5

14

17

21

23

37,50С

4

49,4

74,6

96,7

97,8

24

27

29

31

18 минут

Таблица 3

Изменение показателей свободнорадикального окисления
при введении лекарственных форм кислоты янтарной

Показатель

Контроль

Кислота
янтарная
субстанция

Суппозитории
с кислотой
янтарной
и экстрактом
прополиса

Липосомальная
лекарственная
форма с кислотой
янтарной и экстрактом прополиса

Диеновые
конъюгаты
(гептановая
фракция)

0,496±0,031

0,379±0,042

0,361±0,012

0,349±0,014

Кетодиены
и сопряженные диены

(гептановая
фракция)

0,201±0,007

0,134±0,006

0,123±0,011

0,119±0,012

Шиффовы
основания
(гептановая
фракция)

0,135±0,017

0,066±0,009

0,063±0,008

0,062±0,005

Диеновые
конъюгаты

( изопропанольная фракция)

0,402±0,014

0,228±0,016

0,218±0,019

0,206±0,018

Кетодиены
и сопряженные дины

( изопропанольная фракция)

0,101±0,016

0,098±0,016

0,090±0,015

0,084±0,016

Шиффовы
основания
(изопропанольная фракция)

0,038±0,009

0,0226±0,011

0,0207±0,004

0,0196±0,008

Каталаза, мкат/л

4,13±0,012

4,29±0,018

4,38±0,015

4,43±0,017

Заключение

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что кислота янтарная оказывает выраженное антиоксидантное действие, что проявляется в повышении активности каталазы и снижении концентрации диеновых, кетодиеновых и сопряженных диенов, а также шиффовых оснований. Эти изменения статистически значимы по сравнению с данными контрольной группы. Введение природных антиоксидантов экстракта прополиса усиливает антиокислительную активность, устраняя развитие прооксидантного эффекта.