Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,823

THE MICRORNA LEVELS IN TISSUES OF THE MAMMARY GLAND AT EXPERIMENTAL MODEL OF THE BREAST CANCER

Lykov A.P. 1 Kabakov A.V. 1 Rayter T.V. 1 Bondarenko N.A. 1 Poveschenko O.V. 1 Kazakov O.V. 1 Poveschenko A.F. 1 Strunkin D.N. 2 Kolmykov S.C. 1 Chanyshev M.D. 3 Gulyaeva L.F. 3 Konenkov V.I. 1
1 Scientific institution of clinical and experimental lymphology
2 Scientific institution of clinical immunology
3 Research institute for molecular biology and biophysics SB RAMS
В работе исследованы уровни микроРНК в тканях молочной железы при экспериментальной модели рака молочной железы у крыс линии Wistar. Уровни онкогенной микроРНК (21, 221 и 222) при раке молочной железы увеличены, а уровень опухоль-супрессирующей микроРНК (429) – снижен. Под действием неоадъювантной полихимиотерапии отмечено подавление уровней экспрессии онкогенных микроРНК и увеличение уровней экспрессии опухоль-супрессирующей микроРНК.
In work the microRNA levels in tissues of a mammary gland at experimental model of a breast cancer at rats of the Wistar are investigated. The levels of oncogenic microRNA (21, 221, and 222) in tumor tissues are increased, and the level of tumor-suppressive microRNA (429) are decreased. Under the influence of neoadjuvant polychemotherapy suppression of levels of an expression the oncogenic microRNA and increase in levels of expression microRNA tumor-suppressive is noted.
breast cancer
microRNA
1. Bandopadhyay M., Banerjee A., Sarkar N. et al. Tumor suppressor micro RNA miR-145 and onco micro RNAs miR-21 and miR-222 expressions are differentially modulated by Hepatitis B virus X protein in malignant hepatocytes // BMC Cancer. 2014. Vol. 14. pp. 721–723.
2. Gezer U., Keskin S., Igci A. Abundant circulating microRNAs in breast cancer patients fluctuate considerably during neoadjuvant chemotherapy // Oncology letters. 2014. Vol. 8. pp. 845–848.
3. Krichevsky A.M., Gabriele G. MiR-21: a small multi-faceted RNA // J. Cell Mol. Med. 2009. Vol. 13. pp. 39–53.
4. Kumarswamy R., Volkmann I., Thum T. Regulation and function of miRNA-21 in health and disease // RNA Biology. Vol. 8. pp. 706–713.
5. Raychaudhuri M., Schuster T., Buchner T. et al. Intra­tumoral heterogeneity of microRNA expression in breast cancer // J. Mol. Diagn. 2012. Vol. 4. pp. 376–384.
6. Shah M.Y., Calin G.A. MicroRNAs miR-221 and miR-222: a new level of regulation in aggressive breast cancer // Genome Medicine. 2011. Vol. 3. pp. 56–59.
7. Waters P.S., McDermott A.M., Wall D. et al. Relationship between circulating and tissue microRNAs in a murine model of breast cancer // PLoS ONE. 2012. doi:10.1371/journal.pone. 0050459.
8. Yao Y., Chen S., Zhou X. et al. 5–FU and ixabepilone modify the microRNA expression profiles in MDA/MB-453 triple-negative breast cancer cells // Oncology letters. 2014. Vol. 7. pp. 541–547.

В патогенезе заболеваний изменениям уровней экспрессия микроРНК отводится существенная роль. В последние годы показано, что микроРНК вовлечены в развитие и прогрессирование опухолей, в основном через модуляцию онкогенных или опухоль-супрессирующих механизмов, в том числе и при раке молочной железы. При РМЖ отмечается гетерогенность экспрессии микроРНК, а также выявляются различия по уровням экспрессии между здоровой тканью и карциномой. Более того, уровни микроРНК связаны с прогрессией и метастазированием и являются прогностическим критерием при РМЖ. Так, повышенная экспрессия микроРНК-210 сопряжена с укорочением безрецидивного периода и выживаемостью при РМЖ. Показано, что микроРНК-31, микроРНК-335 и микроРНК-10b вовлечены в процесс обеспечения метастазирования. В доступной литературе мало исследований, посвященных проблеме различий уровней экспрессии микроРНК в образцах опухолей, что необходимо для выработки тактики терапии РМЖ и ее эффективности [5, 7]. Поэтому целью данного исследования стало изучение экспрессии микроРНК в образцах молочной железы в норме и при раке молочной железы.

Материалы и методы исследования

Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с соблюдением принципов Хельсинской декларации BMA (2000). Эксперименты выполнены на 25 неполовозрелых крысах-самках линии Wistar. Животные содержались на стандартной лабораторной диете и имели свободный доступ к воде. У 21 крысы РМЖ индуцировали N-метил-N-нитрозомочевиной (30 мг/кг, Sigma-Aldrich, США), а 4 особи составили группу контроля. Через 6 месяцев у 17 крыс оперативно удалили опухоль молочной железы, а 4 особям не проводилось хирургическое вмешательство до завершения курса неоадъювантной полихимиотерапии (ПХТ) и только после этого была проведена резекция опухоли молочной железы. Курс ПХТ включал 5-фторурацил (Ebewe, Австрия, в дозе 15 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии), метотрексат (Ebewe, Австрия, в дозе 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии) и циклофосфан (ОАО «Биохимия», Саранск в дозе 3 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно однократно 14 дней). Тотальную РНК выделяли из тканей молочной железы с использованием набора реагентов (ЗАО Вектор-БЕСТ) согласно инструкции. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию по матрице микроРНК с использованием набора реагентов (ЗАО Вектор-БЕСТ) согласно инструкции. Для определения количества микроРНК-21, -221, -222 и 429 в тканях молочных желез проводили ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием набора реагентов (ЗАО Вектор-БЕСТ) на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories). В качестве гена сравнения использовали малую РНК U6. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квартилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна –Уитни, и принималась при значениях p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Как видно из таблицы, между уровнями экспрессии микроРНК тканями молочных желез в группе интактных животных и в группе с РМЖ выявлены статистически значимые различия. Так, нами не выявлено статистически значимых различий по уровням экспрессии микроРНК-21 между интактными особями и особями с РМЖ.

Уровни экспрессии микроРНК в тканях молочных желез в норме и при раке молочной железы (Me, Lq-Hq)

Параметры

Интактные

РМЖ

ПХТ

микроРНК-21

0,96

0,73–1,31

1,08

0,73–2,02

0,82

0,78–2,50

микроРНК-221

0,67

0,33–0,84

0,72*,#

0,60–2,89

0,13

0,11–0,15

микроРНК-222

0,35

0,13–0,69

1,10*,#

0,73–1,54

0,03*

0,02–0,04

микроРНК-429

4,59

2,33–5,07

1,40*

0,64–2,06

6,96*

2,30–11,65

Примечание. * – достоверность различия с интактными животными p < 0,05; # – достоверность различия с ПХТ p < 0,05; РМЖ – рак молочной железы; ПХТ – неоадъювантная полихимиотерапия.

В отношении уровней экспрессии микроРНК-221 тканями молочных желез выявлено статистически значимое увеличение данного показателя в группе крыс с РМЖ. Более того, отмечено статистически значимое снижение уровней экспрессии тканями молочных желез микроРНК-221 в группе особей, получивших предварительно курс ПХТ в сравнении с группой особей, у которых проведена только хирургическая резекция опухоли молочных желез (p < 0,01).

Уровни экспрессии тканями молочных желез микроРНК-222 были статистически значимо выше в группе особей, получивших хирургическое вмешательство по сравнению с уровнями экспрессии данной микроРНК в группе интактных животных и в группе особей. получивших курс ПХТ (p < 0,01).

Также выявлено статистически значимое снижение уровней экспрессии тканями молочных желез микроРНК-429 в группе особей, получивших хирургическое вмешательство по сравнению с уровнями экспрессии данного показателя в группе интактных животных (p < 0,01). В то же время в группе особей, получившb[ курс ПХТ, отмечено статистически значимое возрастание уровней экспрессии микроРНК-429 тканями молочных желез в cравнении с интактными животными (p < 0,01).

Выявлена сопряженность уровней экспрессии тканями молочных желез микроРНК-21 с микроРНК-221 в группе интактных животных (r = – 0,90; p < 0,05). В группе особей, получивших курс ПХТ, выявлена прямая и сильная взаимосвязь уровней экспрессии тканями молочных желез микроРНК-221 с уровнями экспрессии микроРНК-222 (r = 0,86; p < 0,01).

Известно, что микроРНК-21 относится к про-онкогенным микроРНК, принимает участие в метаплазии нормальных тканей в опухолевую ткань через регуляцию пролиферации, рост и наделение данных клеток повышенной способностью к инвазии и миграции, в том числе и при РМЖ [3–4]. Более того, при РМЖ часто повышена экспрессия микроРНК-155, микроРНК-210, микроРНК-29с, микроРНК-196а, микроРНК-213, микроРНК-203, микроРНК-29b и микроРНК-93, в то же время уровни экспрессии микроРНК-125b, микроРНК-145, микроРНК-100, микроРНК-10b, микроРНК-125b2, микроРНК-497 и микроРНК-143 подавлена, что приводит к анти-апоптотическому эффекту, усилению пролиферативного потенциала, метастазирования и инвазивности через изменения экспрессии генов в опухолевых клетках [8].

Показано, что микроРНК-221/микроРНК-222 через подавление RAS-RAF-MEK и эпителиально-мезенхимальный переход вовлечены в механизмы прогрессии агрессивной формы рака молочных желез (базальноклеточный фенотип) [6]. Более того, микроРНК-221/микроРНК-222 опосредуют метастазирование клеток опухоли молочной железы, через возрастание инвазивности и миграционной способности клеток подавляя белок TRPS1, который в свою очередь потенцирует возможность протеина ZEB2, необходимого при эпителиально-мезенхимальном переходе. Показано, что повышенная экспрессия клетками опухоли микроРНК-221/микроРНК-222 приводит к подавлению регуляции механизмов супрессии опухоли, а также регулятора клеточного цикла p27 (Kip1) [1].

Показано, что на фоне курсов ПХТ у больных РМЖ отмечается резкое падение уровней экспрессии микроРНК клетками опухоли молочных желез, которое наиболее ярко проявляется при начальных стадиях заболевания и при малых размерах опухоли, в частности для микроРНК-21 [2]. Об эффекте ПХТ на уровни экспрессии микроРНК с супрессорной активностью и онкогенной активностью свидетельствует работа авторов [8], которые показали, что на фоне терапии 5-фторурацилом в комбинации с антиэстрогенами отмечается возрастание уровней экспрессии микроРНК-122, микроРНК-145 и микроРНК-205 (с противоопухолевым действием) и резкое падение уровней экспрессии клетками опухоли молочной железы микроРНК-296, микроРНК-221, микроРНК-210, микроРНК-21 и микроРНК-10b, проявляющих онкогенный эффект [8].

Заключение

Повышенные уровни экспрессии онкогенных микроРНК в тканях опухоли молочной железы при РМЖ у крыс породы Wistar подавляются под действием неоадъювантной полихимиотерапии, а уровень микроРНК с супрессирующей опухоль активностью возрастает.