В патогенезе заболеваний изменениям уровней экспрессия микроРНК отводится существенная роль. В последние годы показано, что микроРНК вовлечены в развитие и прогрессирование опухолей, в основном через модуляцию онкогенных или опухоль-супрессирующих механизмов, в том числе и при раке молочной железы. При РМЖ отмечается гетерогенность экспрессии микроРНК, а также выявляются различия по уровням экспрессии между здоровой тканью и карциномой. Более того, уровни микроРНК связаны с прогрессией и метастазированием и являются прогностическим критерием при РМЖ. Так, повышенная экспрессия микроРНК-210 сопряжена с укорочением безрецидивного периода и выживаемостью при РМЖ. Показано, что микроРНК-31, микроРНК-335 и микроРНК-10b вовлечены в процесс обеспечения метастазирования. В доступной литературе мало исследований, посвященных проблеме различий уровней экспрессии микроРНК в образцах опухолей, что необходимо для выработки тактики терапии РМЖ и ее эффективности [5, 7]. Поэтому целью данного исследования стало изучение экспрессии микроРНК в образцах молочной железы в норме и при раке молочной железы.
Материалы и методы исследования
Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с соблюдением принципов Хельсинской декларации BMA (2000). Эксперименты выполнены на 25 неполовозрелых крысах-самках линии Wistar. Животные содержались на стандартной лабораторной диете и имели свободный доступ к воде. У 21 крысы РМЖ индуцировали N-метил-N-нитрозомочевиной (30 мг/кг, Sigma-Aldrich, США), а 4 особи составили группу контроля. Через 6 месяцев у 17 крыс оперативно удалили опухоль молочной железы, а 4 особям не проводилось хирургическое вмешательство до завершения курса неоадъювантной полихимиотерапии (ПХТ) и только после этого была проведена резекция опухоли молочной железы. Курс ПХТ включал 5-фторурацил (Ebewe, Австрия, в дозе 15 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии), метотрексат (Ebewe, Австрия, в дозе 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии) и циклофосфан (ОАО «Биохимия», Саранск в дозе 3 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно однократно 14 дней). Тотальную РНК выделяли из тканей молочной железы с использованием набора реагентов (ЗАО Вектор-БЕСТ) согласно инструкции. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию по матрице микроРНК с использованием набора реагентов (ЗАО Вектор-БЕСТ) согласно инструкции. Для определения количества микроРНК-21, -221, -222 и 429 в тканях молочных желез проводили ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием набора реагентов (ЗАО Вектор-БЕСТ) на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories). В качестве гена сравнения использовали малую РНК U6. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квартилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна –Уитни, и принималась при значениях p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Как видно из таблицы, между уровнями экспрессии микроРНК тканями молочных желез в группе интактных животных и в группе с РМЖ выявлены статистически значимые различия. Так, нами не выявлено статистически значимых различий по уровням экспрессии микроРНК-21 между интактными особями и особями с РМЖ.
Уровни экспрессии микроРНК в тканях молочных желез в норме и при раке молочной железы (Me, Lq-Hq)
|
Параметры |
Интактные |
РМЖ |
ПХТ |
|
микроРНК-21 |
0,96 0,73–1,31 |
1,08 0,73–2,02 |
0,82 0,78–2,50 |
|
микроРНК-221 |
0,67 0,33–0,84 |
0,72*,# 0,60–2,89 |
0,13 0,11–0,15 |
|
микроРНК-222 |
0,35 0,13–0,69 |
1,10*,# 0,73–1,54 |
0,03* 0,02–0,04 |
|
микроРНК-429 |
4,59 2,33–5,07 |
1,40* 0,64–2,06 |
6,96* 2,30–11,65 |
Примечание. * – достоверность различия с интактными животными p < 0,05; # – достоверность различия с ПХТ p < 0,05; РМЖ – рак молочной железы; ПХТ – неоадъювантная полихимиотерапия.
В отношении уровней экспрессии микроРНК-221 тканями молочных желез выявлено статистически значимое увеличение данного показателя в группе крыс с РМЖ. Более того, отмечено статистически значимое снижение уровней экспрессии тканями молочных желез микроРНК-221 в группе особей, получивших предварительно курс ПХТ в сравнении с группой особей, у которых проведена только хирургическая резекция опухоли молочных желез (p < 0,01).
Уровни экспрессии тканями молочных желез микроРНК-222 были статистически значимо выше в группе особей, получивших хирургическое вмешательство по сравнению с уровнями экспрессии данной микроРНК в группе интактных животных и в группе особей. получивших курс ПХТ (p < 0,01).
Также выявлено статистически значимое снижение уровней экспрессии тканями молочных желез микроРНК-429 в группе особей, получивших хирургическое вмешательство по сравнению с уровнями экспрессии данного показателя в группе интактных животных (p < 0,01). В то же время в группе особей, получившb[ курс ПХТ, отмечено статистически значимое возрастание уровней экспрессии микроРНК-429 тканями молочных желез в cравнении с интактными животными (p < 0,01).
Выявлена сопряженность уровней экспрессии тканями молочных желез микроРНК-21 с микроРНК-221 в группе интактных животных (r = – 0,90; p < 0,05). В группе особей, получивших курс ПХТ, выявлена прямая и сильная взаимосвязь уровней экспрессии тканями молочных желез микроРНК-221 с уровнями экспрессии микроРНК-222 (r = 0,86; p < 0,01).
Известно, что микроРНК-21 относится к про-онкогенным микроРНК, принимает участие в метаплазии нормальных тканей в опухолевую ткань через регуляцию пролиферации, рост и наделение данных клеток повышенной способностью к инвазии и миграции, в том числе и при РМЖ [3–4]. Более того, при РМЖ часто повышена экспрессия микроРНК-155, микроРНК-210, микроРНК-29с, микроРНК-196а, микроРНК-213, микроРНК-203, микроРНК-29b и микроРНК-93, в то же время уровни экспрессии микроРНК-125b, микроРНК-145, микроРНК-100, микроРНК-10b, микроРНК-125b2, микроРНК-497 и микроРНК-143 подавлена, что приводит к анти-апоптотическому эффекту, усилению пролиферативного потенциала, метастазирования и инвазивности через изменения экспрессии генов в опухолевых клетках [8].
Показано, что микроРНК-221/микроРНК-222 через подавление RAS-RAF-MEK и эпителиально-мезенхимальный переход вовлечены в механизмы прогрессии агрессивной формы рака молочных желез (базальноклеточный фенотип) [6]. Более того, микроРНК-221/микроРНК-222 опосредуют метастазирование клеток опухоли молочной железы, через возрастание инвазивности и миграционной способности клеток подавляя белок TRPS1, который в свою очередь потенцирует возможность протеина ZEB2, необходимого при эпителиально-мезенхимальном переходе. Показано, что повышенная экспрессия клетками опухоли микроРНК-221/микроРНК-222 приводит к подавлению регуляции механизмов супрессии опухоли, а также регулятора клеточного цикла p27 (Kip1) [1].
Показано, что на фоне курсов ПХТ у больных РМЖ отмечается резкое падение уровней экспрессии микроРНК клетками опухоли молочных желез, которое наиболее ярко проявляется при начальных стадиях заболевания и при малых размерах опухоли, в частности для микроРНК-21 [2]. Об эффекте ПХТ на уровни экспрессии микроРНК с супрессорной активностью и онкогенной активностью свидетельствует работа авторов [8], которые показали, что на фоне терапии 5-фторурацилом в комбинации с антиэстрогенами отмечается возрастание уровней экспрессии микроРНК-122, микроРНК-145 и микроРНК-205 (с противоопухолевым действием) и резкое падение уровней экспрессии клетками опухоли молочной железы микроРНК-296, микроРНК-221, микроРНК-210, микроРНК-21 и микроРНК-10b, проявляющих онкогенный эффект [8].
Заключение
Повышенные уровни экспрессии онкогенных микроРНК в тканях опухоли молочной железы при РМЖ у крыс породы Wistar подавляются под действием неоадъювантной полихимиотерапии, а уровень микроРНК с супрессирующей опухоль активностью возрастает.