Доклинические исследования – достаточно сложный и затратный как с экономической, так и с научно-практической точки зрения процесс, требующий не только правильного подхода к подбору экспериментальных животных, но и к оснащению самой лаборатории или вивария, где будут проводиться исследования.
В качестве биологической модели свиньи уже достаточно давно привлекают внимание многих исследователей в разных странах [2]. Выведение и использование специальных пород свиней связано с тем, что по строению и функции ряда органов и систем данное животное во многом схоже с человеком. Большинством исследовательских центров предпочтение отдано использованию так называемых миниатюрных пород свиней (в РФ – минисибс, светлогорские свиньи), поскольку указанные породы максимально адаптированы к содержанию в условиях вивария и это содержание сопряжено с меньшими затратами на проведение эксперимента [1].
В рамках программы развития группы компаний «МедИнж» в 2014 году был создан «Центр доклинических исследований», как экспериментальная площадка по апробации новых изделий, производимых компанией «МедИнж» и ее дочерними структурами, разработке новых медицинских технологий и способов лечения больных кардио-, ангио-, нейро-, общехирургического, травматолого-ортопедического и стоматологического профиля. Основной биологической моделью для проведения экспериментальных исследований выбрана свинья. Приступая к экспериментальной работе, мы столкнулись с проблемой отсутствия сколь-либо подробной информации об анестезиологическом обеспечении при продолжительных и травматичных вмешательствах в отечественных источниках. Опыт наших зарубежных коллег главным образом базировался на экспериментах с миниатюрными породами свиней. Что же касается проведения операций на открытом сердце в условиях искусственного кровообращения, то подобным опытом располагают лишь немногие исследовательские центры не только в нашей стране, но и в мире [3].
Цель исследования. Определить возможности использования крупных пород свиней в хирургическом эксперименте. Основная задача исследования – определение возможности выполнения экспериментальных операций на открытом сердце, что продиктовано спецификой деятельности НПП «МедИнж». Кроме того, определенный интерес представляют исследования в области нейрохирургии, травматологии и ортопедии, реконструктивно-восстановительной хирургии, по которым ведется активная научно-исследовательская и опытно-конструкторская работа, направленная на разработку и внедрение в клиническую практику имплантов различного как происхождения, так и назначения. Очевидно, что подобные исследования возможны исключительно в условиях общей анестезии.
Материалы и методы исследования
Экспериментальные исследования проведены на базе центра доклинических исследований группы компаний «МедИнж». Центр доклинических испытаний (далее ЦДкИ) является научным и исследовательским центром, предоставляющим свои услуги по проведению медико-биологических экспериментов научным организациям, а так же юридическим и физическим лицам. В своей работе ЦДкИ руководствуется правилами гуманного обращения с лабораторными (экспериментальными) животными в соответствии с «Хельсинкской Декларацией» Всемирной Медицинской Ассоциации от 2000 года, основными морально-этическими принципами проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированными Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» Этического Кодекса от 1985 года, «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» № 1045-73 от 6.04.1973 г., «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (GLP), утвержденными Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19.06.2003, а так же локальными актами Этического комитета центра доклинических исследований.
В эксперименте нами использованы свиньи пород «Крупная белая» и «Белорусская черно-пестрая» обоего пола, как наиболее распространенной в РФ, в возрасте от 6 до 12 месяцев и весом от 70 до 110 кг. Данные возрастные и весовые характеристики являются наиболее приемлемыми для проведения экспериментальных исследований, в рамках которых планируется выполнение сложных хирургических вмешательств на органах грудной и брюшной полостей, а так же ЦНС, сосудах и опорно-двигательном аппарате.
За 3-5 дней до назначенного эксперимента животное переводили из места общего содержания в отдельный изолированный бокс. В случае если во время эксперимента прогнозировали большую кровопотерю требовался перевод животного в индивидуальный бокс не позднее чем за 14 дней до даты эксперимента, что связано с необходимостью заготовки аутокрови.
В течение первых суток исследовали общий статус животного. Проводили термометрию, исключали совместно с ветеринарами возможные скрытые или явные заболевания. В обязательном порядке животное взвешивали. Проводили исследование общего анализа крови. Не позднее чем за 12 часов до начала эксперимента животное ограничивали в приеме пищи с сохранением достаточного количества воды с целью профилактики обезвоживания. для профилактики возможного образования острых язв ЖКТ назначали блокаторы протонной помпы (омепразол 20-40 мг 1 раз в сутки).
Санитарно-гигиеническую обработку животного проводили за 1,5-2 часа до операции. Адекватная обработка животного требует полного обездвиживания, что достигается введением животного в медикаментозный сон.
Медикаментозный сон (вводная анестезия) является самой важной и ответственной частью на этапе подготовительных мероприятий. В ЦДкИ для обеспечения медикаментозного сна нами применялась комбинация препаратов ветеринарного назначения (ксилазин и золетил) с препаратами, хорошо известными в анестезиологической практике (пропофол).
После введения ксилазина и золетила в стандартных для вида дозировках, и достижения обездвиживания животного проводили пункцию и катетеризацию вены на ухе. Венозный доступ необходим для поддержания медикаментозного сна, что достигается болюсным внутривенным введением пропофола (60-100 мг) с интервалами в 10-15 минут, а так же по необходимости в случае появления признаков пробуждения животного.
Непосредственно гигиеническая обработка животного предусматривала помывку от загрязнений, а так же первичную подготовку операционного поля (сбривание щетины в зоне вмешательства и обработка кожи моющими средствами и антисептическими растворами).
По завершении санитарно-гигиенической обработки животное доставляли в операционный блок ЦДкИ. Поддержание животного в состоянии медикаментозного сна до начала активных мероприятий осуществляли введением раствора пропофола через инфузомат в установленный венозный катетер со скоростью 0,25 – 0,5 мл на кг веса животного в час.
В операционной животное укладывали на операционный стол на спину и фиксировали за конечности ремнями. Такое положение нами было выбрано как наиболее функционально выгодное для проведения подготовительных мероприятий в условиях операционной. Анестезиологическая и вспомогательная операционная бригады налаживали полноценный мониторинг состояния животного на время операции, для чего устанавливали на ухо датчик пульсоксиметра, интраназально вводили датчик температуры, выполняли пункцию и катетеризацию центральной (яремной) вены для проведения инфузионно-трансфузионной терапии и контроля центрального венозного давления, пункцию и катетеризацию мочевого пузыря, установку электродов для снятия ЭКГ, трахеостомию с введением в трахею интубационной трубки и перевод животного на ИВЛ, пункцию и катетеризацию бедренной артерии для последующего мониторинга артериального давления.
Таким образом, подготовка животного к операции нами была разделена на два этапа. Первый этап («грязный») – санитарно-гигиенический, который проводят в условиях индивидуального изолированного бокса и заключается в введении анестетиков для обездвиживания животного (вводный наркоз) с последующим поддержанием медикаментозного сна, а так же непосредственно в проведении санитарно-гигиенической обработки. Второй этап проводят в асептических условиях, и он включает выполнение манипуляций по обеспечению мониторинга за экспериментальным животным, а так же начало проведения общей анестезии и ИВЛ.
Общую анестезию достигали посредством комбинированного эндотрахеального наркоза, включающего применение ветеринарных препаратов (золетил и ксилазин) в сочетании с такими препаратами как пропофол, изофлюран, ардуан в стандартных дозировках. Наш опыт проведения анестезии показал, что продолжительность действия указанных препаратов у свиньи значительным образом отличается от такового у человека. Так, продолжительность действия такого миорелаксанта как ардуан, не превышала 10-15 минут, что требовало более частого дробного введения препарата и тщательного контроля за состоянием мышечного тонуса животного, особенно при выполнении вмешательств на открытом сердце, а так же при выполнении чреспищеводной ЭхоКГ.
Если во время операции предполагали большую кровопотерю или планировали проведение кровяной кардиоплегии, то за 14-17 дней до эксперимента производили забор аутокрови. После предварительной санитарной подготовки животного, в асептических условиях, под общей анестезией выполняли пункцию и катетеризацию яремной вены справа или слева. Непосредственно забор крови осуществляли по стандартной технологии с применением комплекта «Гемакон» в объеме 350-400 мл, с возмещением объема циркулирующей крови коллоидными и кристаллоидными растворами. После процедуры осуществляли контроль показателей общего анализа крови через 5-7 дней и непосредственно накануне операции. Осложнений, связанных с забором и последующей интраоперационной реинфузией консервированной крови, нами отмечено не было.
Результаты исследования и их обсуждение
За период с июня 2013 года по декабрь 2014 в ЦДкИ было выполнено 40 операций на 37 свиньях (3 животных были оперированы дважды). Характер оперативных вмешательств представлен в таблице.
Послеоперационное наблюдение осуществляли непосредственно в операционном блоке в течение первых 4 – 6 часов поддерживая медикаментозный сон введением раствора пропофола через инфузомат, с последующим переводом животного в индивидуальный бокс, после восстановления адекватного самостоятельного дыхания при показаниях SpO2 не менее 90 – 94 % и систолического артериального давления не ниже 100 мм рт ст. В первые часы после операции проводили инфузионную терапию с применением полиионных и коллоидных растворов (плазмалит, тетраспан, аспаркам, хлорид натрия) под контролем показателей кислотно-щелочного равновесия, диуреза и центрального венозного давления. Обезболивание обеспечивали введением ненаркотических аналгетиков из группы НПВС.
|
Название операции |
Кол-во оперированных животных |
|
Протезирование бедренной артерии биологическим протезом |
4 |
|
Отработка торакотомии в условиях искусственного кровообращения с протезированием аорты биологическим протезом (в т.ч. с отработкой технологии кровяной кардиоплегии) |
3 |
|
Пластика твердой мозговой оболочки биологическим материалом. Имплантация новых биологических материалов для реконструктивной хирургии в мягкие ткани брюшной стенки |
3 |
|
Ксенопластика артифициального дефекта бедренной кости |
3 |
|
Протезирование клапана легочной артерии |
7 |
|
Протезирование митрального клапана |
7 |
|
Транскатетерная имплантация стент-графта в грудную аорту |
4 |
|
Транскатетерная имплантация аортального клапана |
3 |
|
Прочие операции |
6 |
|
Всего |
40 |
Летальность составила 32,5 % (13 животных, в т.ч. 3, оперированных повторно). Высокая летальность отмечена на этапе освоения технологии проведения эксперимента. Однако эта жертва была не напрасна. Нами получен уникальный опыт, позволяющий правильно спланировать эксперимент, рассчитать возможные осложнения и предотвратить их. Разработаны рекомендации по подготовке животных к эксперименту, а так же краткое руководство по технике основных манипуляций на подготовительном этапе (пункция и катетеризация яремной вены, трахеостомия, пункция и катетеризация бедренной артерии и т.д.).
Сроки наблюдения после операции от 3 до 6 месяцев. Выведение животных из эксперимента производили путем обездвиживания и выключения чувствительности введением препаратов для наркоза с последующим обескровливанием, либо обездвиживанием при помощи миорелаксантов.
Выводы. Первые эксперименты, проведенные нами на базе центра доклинических исследований, позволяют сделать следующие выводы:
1. Проведение хирургического эксперимента на свинье требует наличия слаженных хирургической, анестезиологической и ветеринарной бригад, не говоря о должном оснащении вивария или лаборатории с полноценным операционным блоком и местами для послеоперационного содержания животных.
2. При проведении хирургического эксперимента следует знать о возможных вариантах воздействия на животное фармпрепаратов, применяемых в медицинской и ветеринарной практике.
3. Свинья, как наиболее близкая с точки зрения анатомического строения биологическая модель человека, может быть использована для проведения хирургического эксперимента по изучению поведения новых изделий и материалов, подлежащих имплантации человеку.