Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

Актуальность изучения кинетики ферментолиза целлюлозы обусловлена необходимостью прогнозирования реакционной способности к ферментолизу предварительно обработанного целлюлозосодержащего сырья. В связи с этим активно проводятся исследования ферментолиза различных по виду сырья и способу выделения образцов целлюлозы [3, 4, 9, 10]. Существуют различные точки зрения на зависимость способности к ферментолизу целлюлозы от степени полимеризации и степени кристалличности [4, 9, 10]. Как правило, исследуют кинетику ферментолиза при низких концентрациях субстрата 5-30 г/л, гарантирующих максимальную степень конверсии.

Цель исследования – экспериментальное изучение кинетики ферментолиза образцов целлюлозы, полученных различными методами из мискантуса и плодовых оболочек овса, при различных концентрациях субстрата.

Материалы и методы исследования

В качестве субстратов использовали образцы целлюлозы, полученные химической обработкой мискантуса и плодовых оболочек овса на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН: азотнокислым (АС) и комбинированным способами (КС). При азотнокислом способе получения целлюлозы сырье подвергалось последовательной обработке разбавленными растворами азотной кислоты и гидроксида натрия. При комбинированном – теми же реактивами в обратном порядке [8]. Определение основных характеристик образцов целлюлозы, приведенных в табл. 1, проводилось по стандартным методикам [7]. Степень кристалличности рассчитывалась по методу Руланда по результатам рентгеноструктурного анализа (дифрактометр «ДРОН-3М» в геометрии на отражение FeKα-излучении с монохроматизацией падающих лучей кристаллом пиролитического графита) [4].

Очевидно (табл. 1), что компонентный состав образцов целлюлозы мискантуса (Ц М) и плодовых оболочек овса (Ц ПОО) представлен по большей части гидролизуемыми компонентами – целлюлозой (90-92 %) и пентозанами (2-7 %). Малая доля относится к негидролизуемым примесям – остаточному лигнину (0,5-3,6 %) и золе (0,1-4,2 %). В образцах целлюлозы, полученных комбинированным способом, наблюдается более высокое содержание гемицеллюлоз вследствие снижения продолжительности стадии обработки азотной кислотой. Значения степени полимеризации для образцов целлюлозы из одного вида сырья, но полученных различными способами, находятся на одном уровне, что позволяет предположить об отсутствии влияния способа обработки на величину данного показателя.

Таблица 1

Физико-химические характеристики образцов целлюлозы

Ферментативный гидролиз субстратов проводился высокоэффективной мультиэнзимной композицией из промышленных ферментных препаратов «Целлолюкс-А» (производитель ООО ПО «Сиббиофарм», г. Бердск) и «Брюзайм BGX» (поставщик компания «Русфермент», г. Москва). Препараты вносились в композицию в соотношении 1:1. Параметры процесса: температура (45±2) °С, рН=(4,6±0,3) (ацетатный буфер), начальные концентрации субстрата от 30 г/л до 120 г/л с шагом 30 г/л, фермент-субстратное соотношение 1:50. Перемешивание осуществлялось на платформе «ПЭ – 6410 М» с частотой колебаний 150 об/мин. Продолжительность гидролиза 72 ч.

Концентрация редуцирующих веществ (РВ) в пересчете на глюкозу в гидролизате определялась спектрофотометрическим методом с использованием реактива на основе 3,5-динитросалициловой кислоты (Panreac, Испания) на «UNICO UV-2804» (США); относительная погрешность метода составляет 3,5 %. Выход РВ рассчитывался на массу субстрата с учетом коэффициента 0,9, обусловленного присоединением молекулы воды к ангидроглюкозным остаткам соответствующих мономерных звеньев в результате гидролиза.

Математические модели, описывающие кинетику процессов ферментолиза субстратов, строились по экспериментальным данным на основе модифицированного уравнения Михаэлиса-Ментен, предложенного Бриггсом и Холдейном [2, 6]. Константы скоростей реакций определялись путём аппроксимации экспериментальных данных методом наименьших квадратов [1].

Результаты исследования и их обсуждение

Зависимости концентрации и выхода РВ через 72 ч ферментолиза от начальной концентрации четырех субстратов Ц М и Ц ПОО представлены в табл. 2. Для всех начальных концентраций субстратов получены выходы РВ от 44 % до 92 %.

Таблица 2

Зависимости концентрации и выхода РВ через 72 ч ферментолиза от начальной концентрации субстратов в диапазоне 30-120 г/л

Согласно классической теории ферментативного катализа Михаэлиса-Ментен, получение конечного продукта (РВ) из субстрата (образца целлюлозы) проходит через образование фермент-субстратного комплекса ES. При этом реакция образования фермент-субстратного комплекса характеризуется константой скорости k1, реакция его распада – k2, реакция образования конечного продукта P – k3. Такой механизм описывается следующим уравнением химической реакции:

, (1)

где S – субстрат; E – фермент; ES – фермент-субстратный комплекс; P – продукт [2, 6].

В таком случае, обозначив концентрации исходного и промежуточного веществ и продукта реакции (РВ) как CS, CES и СP, можно записать систему уравнений, описывающую кинетику ферментолиза. Уравнения, описывающие процесс ферментолиза всех образцов целлюлозы, при их математической записи будут идентичными и отличаются только значениями коэффициентов k1, k2, k3 и Cm (Cm – равновесная концентрация РВ).

В начальный момент времени: t=0; CS=Cm; CES=CP=0.

Кинетические уравнения, описывающие превращения субстрата в РВ, будут записаны следующим образом:

;

; (2)

.

Решением системы уравнений (2) являются выражения [6]:

(3)

(4)

где ; ; ; .

Для построения математической модели необходимо определить величины Cm, k1, k2 и k3. Коэффициенты скоростей реакций k1, k2 и k3 зависят от природы субстрата и от внешних условий (температуры, рН, условий перемешивания субстрата в процессе ферментолиза и др.), которые не менялись. Поскольку в работе фермент взят в избытке, данные коэффициенты не зависят от соотношения фермента и субстрата. Коэффициент Cm, кроме отмеченных факторов, зависит также и от начальной концентрации субстрата, поэтому при нахождении коэффициентов системы уравнений для образцов Ц М и Ц ПОО данные обстоятельства были учтены. Обработка экспериментальных данных осуществлялась следующим образом: уравнения (3) и (4) были объединены в выражение (5), описывающее изменение концентрации РВ:

CP = Cm–(CS+CES). (5)

Выражение (5) использовалось в качестве аппроксимирующей функции, определяющей коэффициенты моделей для субстратов. Аппроксимация экспериментальных данных, представленных в табл. 2, выполнялась по уравнению (5) методом наименьших квадратов [1].

Расчет коэффициентов математических моделей позволил определить константу диссоциации фермент-субстратного комплекса ks (предложенную Михаэлисом и Ментен) и константу Михаэлиса km (предложенную Бриггсом и Холдейном) [2, 6]:

ks=k2/k1;

km=ks+k3/k1.

Из представленных в табл. 3 результатов следует, что с увеличением концентрации субстратов величина Сm, характеризующая конечную концентрацию РВ для субстратов, полученных комбинированным способом, выше, чем для субстратов, полученных азотнокислым способом. То есть превращение этих субстратов в РВ характеризуется более высоким выходом.

Таблица 3

Расчетные значения коэффициентов и констант математических моделей процессов ферментолиза для субстратов Ц М АС, Ц М КС, Ц ПОО АС, Ц ПОО КС

Графическая интерпретация результатов численного моделирования в виде частных решений уравнения (5) с наложением на них экспериментальных точек представлена на рис. 1.

Из представленных на рис. 1 результатов следует, что построенные математические модели хорошо согласуются с экспериментальными данными. Адекватность построенных моделей по выражению (5) с учетом коэффициентов моделей, приведенных в таблице 3, была подтверждена по критерию Фишера [1].

Так как коэффициенты математической модели получены путем аппроксимации экспериментальных данных, то ограничениями по модели в обоих случаях являлись области исходной концентрации субстратов от 30 г/л до 120 г/л и продолжительности процесса ферментолиза от 0 ч до 72 ч.

При оценке эффективности проведенных процессов ферментолиза субстратов необходимо совместно рассмотреть поведение начальной скорости гидролиза и выхода РВ. Из результатов, представленных в табл. 3, следует, что отношение коэффициентов k2 к k1 (величина ks) для образцов целлюлозы (АС) выше, чем для образцов целлюлозы (КС). Величина ks обратно пропорциональна скорости образования фермент-субстратного комплекса: чем больше ks, тем медленнее будет происходить образование фермент-субстратного комплекса. Из полученных данных можно сделать вывод, что из образцов целлюлозы (КС) будет значительно быстрее образовываться фермент-субстратный комплекс, что приведет к росту скорости образования РВ.

Зависимость концентрации РВ от продолжительности ферментолиза для различных концентраций субстратов Ц М (а – АС; б – КС); Ц ПОО (в – АС; г – КС) эксперимент:   – 30 г/л,  – 60 г/л,  – 90 г/л,  – 120 г/л; расчет: — – 30 г/л, ⋅⋅⋅⋅⋅  – 60 г/л, - - -  – 90 г/л, ⋅-⋅-⋅-⋅ – 120 г/л

Скорость процесса образования РВ зависит от величины коэффициента k3 и величины CES. При этом у фермент-субстратных комплексов, образованных с участием образцов целлюлозы (КС), значения k3 выше, чем для образцов целлюлозы (АС). Таким образом, скорость получения РВ в исследуемых процессах у образцов целлюлозы (КС) будет выше, чем у образцов целлюлозы (АС), независимо от вида сырья и начальной концентрации субстрата в рассмотренном диапазоне от 30 г/л до 120 г/л.

Сравнивая между собой аналогичным образом образцы целлюлозы, полученные из различных видов сырья, установлено, что большей скоростью гидролиза обладают образцы целлюлозы, полученные из плодовых оболочек овса.

Полученные результаты могут быть использованы для обоснования видов сырья, их способов химической обработки для получения субстратов для последующего эффективного превращения в продукты биотехнологической трансформации, в частности в этанол.

Заключение

Изучена кинетика ферментолиза образцов целлюлозы, полученных азотнокислым и комбинированным способами (АС и КС) из двух видов сырья – мискантуса и плодовых оболочек овса. Установлено, что кинетика процессов ферментолиза субстратов Ц М и Ц ПОО может быть описана математической моделью, полученной по модифицированному уравнению Михаэлиса-Ментен.

На основе экспериментальных данных определены основные константы, характеризующие кинетику процесса ферментолиза всех субстратов. Рассчитаны значения равновесных концентраций редуцирующих веществ в зависимости от начальной концентрации субстратов. Установлено, что начальная скорость процесса ферментолиза выше для образцов целлюлозы (КС), чем для образцов целлюлозы (АС), независимо от вида сырья и начальной концентрации субстрата в указанном диапазоне от 30 г/л до 120 г/л.

При сравнении между собой образцов целлюлозы, полученных одним способом из различных видов сырья, установлено, что большей скоростью гидролиза характеризуются субстраты из плодовых оболочек овса.

Выход редуцирующих веществ зависит от начальной концентрации субстрата для всех образцов целлюлозы: при увеличении начальной концентрации субстрата от 30 г/л до 120 г/л наблюдается снижение выхода РВ в 1,3-1,5 раза, что обусловлено субстратным ингибированием.