В последние годы отмечено увеличение инфекций, вызываемых синегнойной палочкой, продуцирующей различные факторы патогенности. Нозокоминальные инфекции, обусловленные Pseudomonas aeruginosa, ассоциируются с высоким уровнем смертности, значительно превышающим таковой для инфекций, вызванных другими бактериальными патогенами, сложностями в антимикробной терапии [1,3,13]. Наиболее сильнодействующим фактором патогенности Pseudomonas aeruginosa признан экзотоксин А (ЭТ-А): его токсичность (LD50) для мышей, по различным данным, составляет от 2,3 мкг/кг до 7 мкг/кг [5-7]. Смерть животных при внутрибрюшинном введении токсина наблюдается в течение 5 дней [2, 10].
Установлено, что синегнойный экзотоксин А обладает тропизмом ко многим жизненно важным органам и системам, вызывая в них цитотоксический эффект. При действии его на клетки эукариот наблюдается набухание митохондрий, повышение проницаемости мембран и нарушение транспорта электронов в цитохромной системе. В опытах in vivo обнаружено, что экзотоксин уменьшает поглощение кислорода клетками почек и повышает – клетками печени [4,7]. Однако эти изменения являются вторичными, так как главным нарушением, приводящим к гибели изолированных клеток или организма животного, является нарушение синтеза белка. Впервые это установлено O.R. Pavlovskis,1974 [9] и подтверждено многими исследователями [4,7,12].
Доказано, что в основе молекулярного механизма действия экзотоксина А лежит ферментативный гидролиз никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и рибозилирование фактора элонгации 2 (ФЭ-2), который принимает участие в удлинении полипептидной цепи на рибосомах клетки:
НАД + токсин АДФР + никотинамид + Н+
НАД + токсин + ФЭ-2 АДФР-ФЭ-2+ никотинамид + Н+
При этом комплекс АДФР-ФЭ-2 становится неактивным и не может участвовать в синтезе белка.
Система факторов естественной защиты оказывает решающее влияние на генерализацию синегнойной инфекции, во многом определяя течение и исход заболевания. В этой связи представляется важным выяснить влияние экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa на некоторые показатели естественного иммунитета.
Материалы и методы исследования
Эксперименты проведены на 110 половозрелых белых нелинейных мышах весом 25-30 г. через 1, 2 и 5 суток после внутрибрюшинного введения экзотоксина в дозах 0,1LD50, 1,0 LD50 и 5,0 LD50. Животные содержались на стандартной диете вивария и имели свободный доступ к воде. для анализа ткани у мышей забирали декапитацией.
Оценку иммунного статуса нелинейных мышей проводили по показателям массы лимфоидных органов (тимуса и селезенки) и количеству лимфоцитов в них, концентрации циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови, по состоянию неспецифической резистентности животных, которое оценивалось по изменению смертности отравленных экзотоксином животных после введения им кишечной палочки в количестве, вызывающем в контроле 20 % смертность и количеству катионных белков в нейтрофилах на основании лизосомально-катионного теста (ЛКТ).
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования иммунного статуса нелинейных мышей представлены в таблице. Из данных таблицы видно, что уже на первые сутки интоксикации отмечаются достоверные изменения массы и клеточного состава лимфоидных органов. В это время наибольшие отклонения показателей от контрольных значений отмечаются в селезенке. В дальнейшем (на 2 и 5 сутки интоксикации) резко снижается количество лимфоцитов в тимусе, что свидетельствует о глубоком угнетении клеточного звена иммунной системы, что особенно заметно при введении животным больших доз экзотоксина (1 и 5 LD50).
Иммунотоксические свойства экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa для нелинейных мышей при его внутрибрюшинном воздействии в различных дозах
|
Иммунологический показатель, ед. измерения |
Группа животных |
Значение показателя в динамике интоксикации |
||
|
1 сутки |
2 суток |
5 суток |
||
|
Масса тимуса, г. |
контроль |
0,0370,004 |
||
|
0,1LD50 |
0,0480,015 |
0,0620,013 |
0,0520,008 |
|
|
LD50 |
0,0460,006 |
0,050 0,014 |
0,0410,002 |
|
|
5LD50 |
0,0570,014 |
0,0450,006* |
- |
|
|
Количество лимфоцитов в тимусе, млн. |
контроль |
13,12,5 |
||
|
0,1LD50 |
21,85,7 |
22,02,1 |
27,51,1* |
|
|
LD50 |
36,87,3* |
7,62,4* |
5,81,6* |
|
|
5LD50 |
11,42,3 |
8,02,5 |
- |
|
|
Масса селезенки, г. |
контроль |
0,2250,018 |
||
|
0,1LD50 |
0,1330,018* |
0,1960,027 |
0,2130,027 |
|
|
LD50 |
0,1450,019 |
0,510,020* |
0,2440,052 |
|
|
5LD50 |
0,1240,023* |
0,1660,017 |
- |
|
|
Количество лимфоцитов в селезенке, млн. |
контроль |
52,14,9 |
||
|
0,1LD50 |
40,43,6* |
54,64,8 |
39,82,1* |
|
|
LD50 |
39,84,6* |
41,45,7 |
39,04,5* |
|
|
5LD50 |
59,616,1 |
55,06,1 |
- |
|
|
ЦИК, компл/100 мл |
контроль |
105,619,2 |
||
|
0,1LD50 |
74,310,3 |
55,210,8* |
47,217,5* |
|
|
LD50 |
100,00,20 |
91,828,6 |
78,235,7 |
|
|
5LD50 |
56,720,6 |
77,561,4 |
- |
|
|
ЛКТ, ед |
контроль |
1,58 ± 0,14 |
||
|
0,1LD50 |
1,02±0,1 |
1,08 ± 0,15* |
1,31 ± 0,20 |
|
|
LD50 |
0,43 ± 0,12* |
0,96 ± 0,09* |
1,10 ± 0,13* |
|
|
5LD50 |
0,27 ± 0,06* |
0,13 ± 0,04* |
- |
|
|
Смертность после введения E.coli |
контроль |
21 |
21 |
21 |
|
0,1LD50 |
0 |
50 |
75 |
|
|
LD50 |
33 |
84 |
80 |
|
|
5LD50 |
100 |
84 |
- |
|
|
Примечание. Данные представлены как среднее ошибка среднего. * – достоверность отличий показателей от контрольных по t-критерию Стьюдента при р0,05. Набор показателей на 5 сутки для дозы 5LD50 отсутствует в связи с падежом особей данной группы. Каждая группа включала 10 животных. |
||||
Во все сроки наблюдения происходит резкое дозозависимое снижение неспецифической резистентности организма, определяемое как увеличение смертности подопытных животных после введения им кишечной палочки. Наибольшие изменения резистентности организма наблюдаются на 2 и 5 сутки интоксикации, причем они отмечаются в эти сроки во всем исследованном интервале доз токсина (от 0,1 до 5 LD50).
Анализ корреляционных связей между исследованными показателями иммунной системы показал наличие линейной зависимости между количеством лимфоцитов в тимусе и смертностью животных, которым вводили кишечную палочку (r=0,80, F=9,33).
Известно, что уровень катионных белков позволяет оценить активность кислороднезависимого механизма бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов и является показателем резистентности организма к инфекциям. Как видно из табл., при введении больших доз ЭТ-А имеются значительное дозо- и времязависимое падение уровня катионных белков нейтрофилов. Так через 2 суток после введения ЭТ-А в дозе равной 5LD50 содержание катионных белков уменьшилось в 12 раз. Падение ЛКТ принято считать неблагоприятным прогностическим признаком при различного рода тяжелых инфекционных заболеваниях и химических интоксикациях.
Наименее выражено изменение концентрации циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови экспериментальных животных, наблюдающееся только при введении малых доз экзотоксина.
Таким образом, при воздействии на организм нелинейных мышей экзотоксина А синегнойной палочки наблюдаются значимые нарушения функционирования иммунной системы. Проведенные исследования свидетельствует о глубине поражения клеточного звена иммунной системы, что подтверждает раннее полученные данные [8,10,11]. Особенно следует отметить стойкое снижение неспецифической резистентности организма биообъектов во все сроки наблюдения, проявляющееся даже при воздействии сублетальных доз исследуемого токсина.