При аэробном превращении углеводов в цикле Кребса сходятся все метаболические пути белков, жиров и углеводов [2]. В этот цикл входит восемь реакций, которые контролируются дегидрогеназами, которые участвуют в дегидрировании янтарной кислоты с образованием фумаровой кислоты. Все ферменты цикла трикарбоновых кислот находятся внутри митохондрий на внутренней поверхности их мембран [4]. Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) принадлежит к обширной и важной группе ферментов – оксидоредуктазам, которые катализируют процессы биологического окисления и отражают интенсивность протекания энергетических процессов в клетках и тканях организма. По её активности судят об интенсивности клеточного аэробного дыхания [2]. СДГ является наиболее чувствительной ферментной реакцией в дыхательной цепи митохондрий, реагирующей на незначительные физиологические нагрузки, которые испытывает организм [3, 4]. Присутствие этого фермента внутри клетки выявляется цитохимически в присутствии тетразолиевых соединений, которые акцептировать водород и образуют нерастворимых окрашенные соединения [3].
Нами установлены основные критерии содержания и локализации СДГ в лейкоцитах свиней крупной белой породы различных возрастных групп, содержащихся в свиноводческих хозяйствах Кировской области [1], поэтому считаем оправданным и необходимым проведение подобных цитохимических исследований крови лошадей, находящихся в лаборатории коневодства Вятской государственной сельскохозяйственной академии.
Цель исследования: выявление зависимости между метаболическими сдвигами, происходящими в организме и содержанием сукцинатдегидрогеназы в лейкоцитах лошадей, содержащихся в лаборатории коневодства Вятской ГСХА по морфологическим и цитохимическим признакам в зависимости от пола и возраста.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести сравнительный цитологический и цитохимический анализ, дать характеристику особенностей клеток крови лошади.
2. Определить возрастные особенности клеточного состава крови лошадей.
3. Определить цитологические и цитохимические показатели СДГ клеток крови лошадей.
Научная новизна. Впервые определены морфологические и цитохимические критерии содержания СДГ в лейкоцитах крови лошадей в условиях Кировской области.
Материалы и методы исследования
Взятие крови проводили из яремной вены у лошадей, содержащей в лаборатории коневодства Вятской ГСХА. Группы клинически здоровых животных составлены по возрасту и половой принадлежности: 9 жеребцов и 9 кобыл в возрасте от 4 до 17 лет. Мазки крови окрашивали на СДГ по Р.П. Нарциссову [5]. С помощью бинокулярного микроскопа БИОЛАМ (ув.10х100) изучали препараты, подсчитывали лейкоцитарную формулу, результаты цитохимического исследования оценивали по методу G. Astaldi и L. Verga [8]. Результаты исследования представляли в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК) по Kaplow L. [9]. Интенсивность СДГ в нейтрофилах и лимфоцитах оценивали путем полуколичественного анализа, учитывали дифференциальную окраску специфических гранул, их расположение и концентрацию в клетках крови, используя градации характера реакции в клетках:
+ – в цитоплазме выявляются отдельные гранулы или «венчик» из одного ряда окрашенных зерен; ++ – в цитоплазме клеток выявляется венчик из 2 рядов окрашенных гранул или интенсивно окрашенная цитоплазма в нейтрофильных гранулоцитах; +++ – в цитоплазме лимфоцитов выявляются три венчика из окрашенных гранул, цитоплазма нейтрофилов ярко- красного цвета с четкой зернистостью.
Результаты исследования и их обсуждение
Впервые у лошадей в наших исследованиях выявлено уравнивание в девятилетнем возрасте числа лимфоцитов и нейтрофилов – «физиологический перекрест» лейкоцитарной формулы крови, обусловленный формированием системы специфического иммунитета.
Нами установлено, что активность цитохимических показателей нейтрофилов и лимфоцитов лошадей снижается с возрастом, отражая интенсивность развития лимфоидной системы в различные периоды постнатального онтогенеза (табл. 1). Изменения содержания СДГ в лейкоцитах лошади свидетельствуют о метаболической активности и способности данных клеток крови к фагоцитозу и созданию клеточного иммунитета.
Установлено, что изменения концентрации сукцинатдегидрогеназы в нейтрофилах наиболее вариабельны у жеребцов (СЦК 0,76…2,15). Средний цитохимический коэффициент СДГ у кобыл отличается относительной стабильностью (СЦК 0,75…1,5). Наиболее высокие показатели СДГ отмечены у кобыл Прибыли, 2004 г.р. (СЦК-1,5) и Гренады, 2009 г.р. (СЦК-1,49), а также у жеребца Денди, 2005 г.р. (СЦК-2,15). Наименьшие показатели содержания СЦК в нейтрофилах установлены у жеребца Лексуса, 2005 г.р. и кобылы Ласки, 1997 г.р. как самой старой среди всех лошадей лаборатории коневодства Вятской ГСХА.
Таблица 1
Показатели среднего цитохимического коэффициента сукцинатдегидрогеназы в клетках крови лошадей лаборатории коневодства ВГСХА
|
Кличка, год рождения |
СЦК СДГ |
|
|
нейтрофилы |
лимфоциты |
|
|
Фуджи 2003 |
1,27 |
1,21 |
|
Пи-Фи 2003 |
1.1 |
1,0 |
|
Камыш 2003 |
1,18 |
1,08 |
|
Лексус 2005 |
0,76 |
0,9 |
|
Де-Факто 2005 |
1,16 |
1,48 |
|
Денди 2005 |
2,15 |
2,09 |
|
Голиаф 2008 |
1,25 |
1,19 |
|
Эмигрант 2009 |
1,15 |
1,24 |
|
Денвер 2010 |
1,04 |
1,03 |
|
Ласка 1997 |
0,75 |
0,7 |
|
Флоренция 1998 |
1,33 |
1,18 |
|
Гутиэра 1999 |
1,32 |
1,14 |
|
Эллада 2000 |
1,40 |
1,28 |
|
Госпожа Гаприетта 2001 |
1,29 |
1,23 |
|
Прибыль 2004 |
1,50 |
1,47 |
|
Дорина 2005 |
1,22 |
1,19 |
|
Сантолина 2005 |
1,34 |
1,37 |
|
Гренада 2009 |
1,49 |
1,52 |
У животных одной возрастной группы (2005 г.р.) СЦК более высокий у кобыл Дорины и Сантолины (СЦК-1,22 и 1,34 соответственно), чем у жеребцов, например, жеребца Де-факто (СЦК-1,16).
Таблица 2
Средние значения цитохимических показателей СДГ в лейкоцитах крови кобыл и жеребцов, содержащихся в лаборатории коневодства ВГСХА, M ± m
|
Виды клеток |
Жеребцы |
Кобылы |
|
Нейтрофилы |
1,05 ± 0,18 |
1,29 ± 0,07 |
|
Лимфоциты |
1,03 ± 0,19 |
1,23 ± 0,07 |
В лимфоцитах среднее содержание сукцинатдегидрогеназы выше у кобыл, чем у жеребцов (табл. 2). Гранулы фермента СДГ располагаются по периферии цитоплазмы клетки в виде прерывистого пояска, что оценивается как показатель 2 и 3 степени (рисунок). Наибольшие показатели СЦК отмечены у кобыл Гренады и Прибыли (СЦК – 1,52 и 1,47 соответственно), что находится в прямой взаимосвязи с показателем содержания фермента в нейтрофилах.
Мазок крови Эллады, 2000 г.р. Гранулы СДГ в нейтрофиле (слева) и лимфоците (справа), 2 степень. Окраска по Нарциссову Р.П. Ув. х1000
Наименьшие значения этого показателя в лимфоцитах отмечены у Лексуса, что коррелирует с низким показателем СДГ в нейтрофилах этого животного (СЦК-0,9 и 0,76). Косвенно это свидетельствует о снижении защитных резервов организма данного жеребца, низкой метаболической активности лейкоцитов, что требует назначения дополнительной иммунокоррекции.
Проведенные цитохимические методы изучения локализации и концентрации сукцинатдегидрогеназы в лейкоцитах дополняют классические лабораторные и иммунологические методики определения функционального состояния органоидов клеток крови. Данное исследование иллюстрирует состояние ферментативного статуса нормальных и патологических клеток крови лошадей и их иммунологических резервов в постнатальном онтогенезе.
Выводы
1. Выявлено уравнивание в девятилетнем возрасте у лошадей, содержащихся в лаборатории коневодства Вятской ГСХА, числа лимфоцитов и нейтрофилов – «физиологический перекрест» лейкоцитарной формулы крови.
2. Средние показатели по СДГ в нейтрофилах и лимфоцитах выше у кобыл, чем у жеребцов.
3. СЦК сукцинатдегидрогеназы в нейтрофилах отличается стабильностью во всех возрастных группах и составляют у кобыл СЦК-1,29 ± 0,07, у жеребцов СЦК-1,05 ± 0,18.
4. Содержание СДГ в лимфоцитах ниже по сравнению со значениями в нейтрофилах и составляет у кобыл СЦК-1,23 ± 0,07, у жеребцов СЦК-1,03 ± 0,19.