Известно, что в ходе реализации своей морфогенетической функции Т-лимфоциты информируют организм реципиента не только о необходимости запуска программы пролиферации ткани, но и обо всех особенностях этого процесса, обусловленных исходным сигналом к регенерации, причем лимфоидные клетки способны переносить реципиентам информацию о стадии регенерационного ответа, развивающегося в организме донора [1, 8]. Ранее нами было установлено, что суммарная РНК лимфоидных клеток обладает модулирующим эритропоэз действием в норме и при экспериментальной полицитемии [2, 3, 18], а суммарная РНК лимфоцитов пациентов с истинной полицитемией стимулирует пролиферацию и дифференцировку эритроидных клеток в культуре и в костном мозге крыс с бензольной анемией [4, 5]. Целью настоящего исследования явилось изучение эффекта суммарной РНК лимфоцитов, выделенных из организма животного в период начала торможения постгеморрагической пролиферации эритроидной ткани, на физиологический и компенсационный эритропоэз в культуре эритробластических островков (ЭО) костного мозга.
Материалы и методы исследования
Эксперименты были проведены в соответствии c Национальным стандартом Российской Федерации «Принципы надлежащей лабораторной практики», утвержденным и введенным в действие Приказом Ростехрегулирования № 544-ст от 02.12.2009. Все манипуляции с животными производили под эфирным наркозом, эвтаназию грызунов осуществляли путем цервикальной дислокации, также проводимой под эфирным наркозом. 5 здоровым крысам-самцам массой 200–260 граммов было произведено кровопускание в объеме 2 % от массы тела. Через 96 часов после кровопотери эти животные были выведены из эксперимента. Лимфоидные клетки из их селезенок выделяли путем суспендирования ткани в стеклянном гомогенизаторе, после чего взвесь фильтровали через капроновый фильтр и трижды отмывали суспензию клеток 0,9 % раствором NaCl. Суммарную РНК, выделенную из лимфоцитов методом гуанидин тиоцианат – фенол – хлороформной экстракции по Хомчинскому, добавляли в чашки Петри непосредственно перед началом культивирования в концентрации 2 или 4 мкг/мл культуральной среды.
У 10 интактных крыс из костного мозга бедренных костей выделяли ЭО и культивировали их 24 часа в газопроточном мультигазовом инкубаторе [11]. Для моделирования физиологического эритропоэза в каждую чашку Петри добавляли по 0,5 МЕ/мл рекомбинантного эритропоэтина (ЭПО) человека «Рекормон» («Boehringer Mannheim GmbH», Германия), для моделирования компенсационного эритропоэза – по 1,5 МЕ/мл ЭПО [17]. Культивирование производилось при температуре 37 °С, относительной влажности 95 % и содержании СО2 4,5 %. Всего в работе было проанализировано 30 культур ЭО.
В полученных препаратах определяли общее количество ЭО на 1 см2 поверхности культурального сосуда и распределение их по классам зрелости [9,10]. «Корона» ЭО 1-го класса (ЭО1) была представлена проэритробластами и базофильными эритробластами с числом клеток от 2 до 8; «корона» ЭО 2-го класса (ЭО2) – базофильными и полихроматофильными эритробластами с числом клеток от 9 до 16; ЭО 3-го класса (ЭО3) содержали от 17 до 32 полихроматофильных и оксифильных эритробластов; «корона» инволюцирующих островков (ЭОинв) состояла из полихроматофильных, оксифильных эритробластов и ретикулоцитов с числом ядросодержащих клеток менее 16. Реконструирующиеся островки (ЭОрек) имели в своей «короне» как зрелые клетки (оксифильные эритробласты и ретикулоциты), так и молодые проэритробласты и/или базофильные эритробласты. Для оценки темпа развития ЭО в культуре использовались расчетные показатели интенсивности вовлечения КОЕэ в дифференцировку (ЭО1 + ЭОрек), созревания эритробластов (ЭО3 + ЭОинв / ЭО1 + ЭО2 + ЭОрек) и повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз (ЭОрек / ЭОинв). Кроме того, отдельно подсчитывали ЭО каждого класса зрелости, контактирующие с лимфоидными клетками.
Полученные результаты обрабатывались методами описательной статистики с расчетом средних значений, ошибки среднего, доверительных интервалов, стандартного отклонения. Сравнения групп проводились методами непараметрической статистики с использованием критериев Манна-Уитни и хи-квадрат.
Результаты исследования и их обсуждение
Присутствие препарата РНК лимфоцитов селезенки анемизированных животных в культуральной среде как в концентрации 2 мкг/мл, так и в количестве 4 мкг/мл приводило к нарушению физиологического темпа развития эритроидных клеток в ЭО (табл. 1). При анализе показателей развития ЭО в культуре было выявлено, что торможение эритропоэза развивается в результате подавления процесса присоединения КОЕэ к мембране центральных макрофагов и снижения темпа вовлечения свободных макрофагов в эритропоэз. Кроме того, о замедлении процесса дифференцировки и созревания эритроидных клеток свидетельствовало увеличение показателя созревания эритробластов, что, вероятно, было обусловлено замедлением процесса денуклеации оксифильных нормобластов в ЭО3 и ЭОинв, а также задержкой выхода ретикулоцитов из их «короны». Подобное явление торможения созревания эритроидных клеток в ЭО костного мозга было отмечено ранее при экспериментальной спленомегалии [19].
В модели компенсационного эритропоэза при добавлении исследуемой суммарной РНК лимфоцитов наблюдалась такая же картина угнетения формирования ЭО: через 24 часа культивирования снижалось число вновь образованных островков, замедлялся процесс вовлечения новых макрофагов в эритропоэз и увеличивалась продолжительность созревания эритробластов (табл. 2).
Известно, что интенсивность эритропоэза in vitro прежде всего зависит от дозы внесенного в культуру ЭПО, что было показано в работах по изучению динамики развития эритроидных клеток [13]. Однако супрессорное действие суммарной РНК, выделенной из лимфоцитов на этапе начала торможения эритропоэза в организме доноров, было отчетливо выражено даже в тех культурах ЭО, в которых равновесие между стимулирующими и угнетающими эритроидный росток факторами было смещено в сторону активации (модель компенсационного эритропоза). При микроскопии препаратов культур ЭО, содержащих 1,5 МЕ/мл ЭПО, мы обратили внимание на необычайно частую встречаемость лимфоидных клеток в «короне» островков 3-го класса зрелости (табл. 3).
Таблица 1
Влияние суммарной РНК лимфоцитов селезенки анемизированных животных на развитие ЭО в модели физиологического эритропоэза
|
Расчетные показатели |
0,5 МЕ/мл ЭПО (контроль) |
0,5 МЕ/мл ЭПО + 2 мкг/мл суммарной РНК лимфоцитов |
0,5 МЕ/мл ЭПО + 4 мкг/мл суммарной РНК лимфоцитов |
|
Показатель интенсивности вовлечения КОЕэ в дифференцировку |
18,7 ± 0,08 |
11,1 ± 0,07* |
8,6 ± 0,05* |
|
Показатель созревания эритробластов |
2,8 ± 0,01 |
4,6 ± 0,02* |
5,9 ± 0,02* |
|
Показатель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз |
0,23 ± 0,004 |
0,14 ± 0,001* |
0,11 ± 0,001* |
Примечание. * – достоверность различий между контрольными и опытными показателями (p < 0,05).
Таблица 2
Влияние суммарной РНК лимфоцитов селезенки анемизированных животных на развитие ЭО в модели компенсационного эритропоэза
|
1,5 МЕ/мл ЭПО (контроль) |
1,5 МЕ/мл ЭПО + 2 мкг/мл РНК лимфоцитов |
1,5 МЕ/мл ЭПО + 4 мкг/мл РНК лимфоцитов |
|
|
Показатель интенсивности вовлечения КОЕэ в дифференцировку |
25,2 ± 0,1 |
19,3 ± 0,07* |
11,6 ± 0,06* |
|
Показатель созревания эритробластов |
2,1 ± 0,03 |
2,7 ± 0,02* |
4,2 ± 0,01* |
|
Показатель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз |
0,33 ± 0,001 |
0,23 ± 0,002* |
0,12 ± 0,02* |
Примечание. * – достоверность различий между контрольными и опытными показателями (p < 0,05).
Таблица 3
Влияние суммарной РНК лимфоцитов анемизированных животных на процентное содержание ЭО с лимфоидными клетками в «короне»
|
Условия культивирования |
1,5 МЕ/мл ЭПО (контроль) |
1,5 МЕ/мл ЭПО + 4 мкг/мл суммарной РНК |
|
% ЭО 1-го класса |
20,6 ± 1,6 |
15,8 ± 2,7 |
|
% ЭО 2-го класса |
11,5 ± 1,3 |
8,1 ± 1,2 |
|
% ЭО 3-го класса |
9,1 ± 1,8 |
26,5 ± 1,4 * |
|
% ЭОинв |
6,4 ± 0,5 |
8,6 ± 1,9 |
|
% ЭОрек |
25,5 ± 2,1 |
19,6 ± 2,5 |
Примечание. * – достоверность различий между контрольными и опытными показателями (p < 0,05).
Ранее подобные подсчеты проводились нами при изучении влияния разных доз эритропоэтина на интенсивность эритропоэза in vitro, и было установлено, что наибольшее число контактов с лимфоидными клетками имеют островки с активно пролиферирующими клетками в «короне» – ЭО 1-го класса и реконструирующиеся ЭО [7, 12, 14, 16]. Однако при добавлении в культуральную среду исследуемой РНК наиболее часто с лимфоидными клетками стали контактировать ЭО 3-го класса зрелости, в которых одновременно наблюдалось замедление созревания оксифильных нормобластов. Исходя из полученных данных, можно предположить, что к 96-му часу после кровопотери, при запуске программы торможения репаративной регенерации красного ростка кроветворения, суммарная РНК лимфоцитов способствует адгезии особой популяции лимфоидных клеток костного мозга к мембране центральных макрофагов зрелых ЭО, или же под влиянием РНК, выделенной из лимфоцитов донора на стадии торможения эритропоэза, лимфоидные клетки, присоединившись к «короне» зрелых островков, начинают выделять биологически активные вещества, тормозящие процесс денуклеации оксифильных нормобластов. Это, в свою очередь, приводит к уменьшению количества ретикулоцитов, открепляющихся от «короны» ЭО и выходящих в культуральную среду (а в живом организме – в сосудистое русло). Подобный феномен привлечения лимфоидных клеток в процессы дифференцировки и созревания эритробластов был отмечен при изучении механизмов действия различных тормозящих эритропоэз соединений – молекул средней массы, выделенных из крови обожженных животных, и макрофагального колониестимулирующего фактора [6, 15].
Выводы
1. Суммарная РНК, выделенная из лимфоцитов селезенки доноров через 96 часов после кровопотери, тормозит эритропоэз in vitro.
2. Супрессорное действие исследуемой суммарной РНК проявляется и при физиологическом темпе развития эритроидных клеток, и в модели компенсационного эритропоэза, несмотря на повышенное в последнем случае содержание эритропоэтина в культуральной среде.
3. Под влиянием суммарной РНК, выделенной из лимфоцитов селезенки на начальной стадии торможения постгеморрагической регенерации эритроидной ткани, увеличивается адгезия лимфоидных клеток к ЭО, содержащим в «короне» созревающие эритробласты.
Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013–2020 годы по теме «Создание клеточных моделей молекулярных процессов в органах и тканях» (НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича) и комплексной темы НИР «Регуляция кроветворной и некроветворной функций клеток костного мозга в эксперименте и клинике», №01201354257 (Южно-Уральский государственный медицинский университет).