На сегодняшний день проблема ишемического инсульта – проблема национального масштаба, которая требует дальнейшего поиска решения и углубленного изучения данного заболевания. Среди механизмов вторичного повреждения ткани мозга и «доформирования» инфаркта при инсультах важное место принадлежит реакции локального воспаления в области ишемического очага. Воспалительную реакцию поддерживает активированная микроглия, продуцирующая ряд провоспалительных медиаторов, в том числе IL-1, IL-6, что в конечном итоге приводит к отсроченным нейрональным потерям [3, 5]. Последовательные этапы формирования воспалительной реакции изучены достаточно хорошо, в том числе и роль клеточных рецепторов, передающих активационные сигналы после взаимодействия с различными бактериальными патогенами или эндогенными паттернами [3, 4]. Толл-рецепторы (англ. Toll-like receptor, TLR; от нем. toll – замечательный) экспрессированы на поверхностных мембранах многих типов лейкоцитов, особенно макрофагов и дендритных клеток, выполняют определенную функцию в патогенезе неинфекционных заболеваний [6]. Toll-белки ответственны за активацию синтеза провоспалительных цитокинов и обеспечивают миграцию лейкоцитов в очаг воспаления. Они запускают иммунный ответ путем активации ядерного фактора, который инициирует транскрипцию генов провоспалительных цитокинов [7].
Литературные данные по изучению полиморфизма данных рецепторов у больных инсультом очень скудные, что не позволяет в полной мере оценить их роль в патогенезе данного заболевания.
Цель исследования – сравнить частоту генотипов и аллелей генетического полиморфизма TLR4(Asp299Gly) и TLR6(Ser249Pro) среди относительно здоровых людей и больных мозговым инсультом. Определить содержание IL-1β и IL-6 у больных мозговым инсультом в разные периоды заболевания (1, 10 и 21-е сутки), в том числе и с учетом носительства выявленных генотипов и аллелей.
Материалы и методы исследования
В клиническую группу вошли 128 пациентов обоих полов в возрасте 52 ± 5,4 лет, находящихся на лечении в стационарах г. Читы с диагнозом мозговой инсульт. Критериями отбора больных в исследуемую группу явились: наличие объективно доказанного (методами нейровизуализации) ОНМК и отсутствие в анамнезе онкологических и гематологических заболеваний, инфекционных заболеваний и другой острой соматической патологии (инфаркт миокарда). Контрольную группу составили 113 относительно здоровых резидентов обоих полов, не имеющих признаков цереброваскулярной патологии, в возрасте 43 ± 5,4 лет (р > 0,05). Представители клинической и контрольной групп являлись жителями Забайкальского края. У всех обследуемых было получено информированное согласие на участие в исследовании. Работа одобрена ЛЭК (протокол № 30 от 9.11.11 г.).
Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической венозной крови. Амплификацию проводили в термоциклере «Бис-М110» (ООО «Бис-Н», Новосибирск). В работе использовались стандартные наборы НПФ «Литех» (Москва). Визуализация продуктов амплификации выполнялась в проходящем в ультрафиолетовом свете после электрофореза в 3 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия.
Концентрацию интерлейкина-1β (IL-1β), интерлейкина-6 (IL-6) исследовали в плазме крови, взятой трижды у больных мозговым инсультом (в 1-е, на 10-е и 21-е сутки от начала заболевания) и единовременно у здоровых резидентов. Определение данных цитокинов проводили тест-системами фирмы «Вектор-Бест» (Россия) с помощью иммуноферментного анализатора Expert 96 (Великобритания).
Статистическая обработка результатов выполнялась с использованием программных пакетов Biostat и Excel 2007. При проведении описательной статистики вычисляли медиану (Ме), 25 и 75 процентили. Достоверность различий оценивали по критерию Манна – Уитни (u-тест). Различия считались статистически значимыми при p < 0,05. Для определения популяционного равновесия частот аллельных вариантов генов применялся закон Харди – Вайнберга. При сравнении частот аллелей и генотипов по качественному бинарному признаку пользовались критерием χ2. Степень риска развития событий оценивали по величине отношения шансов (odd ratio (OR)) с расчетом для него 95 % доверительного интервала (CI).
Результаты исследования и их обсуждение
К цитокинам, значение которых в патогенезе ишемического инсульта доказано, относятся ФНО-α, IL-1, IL-6, IL-10, IL-8. Так, в одном из исследований было отмечено, что повышение уровня IL-6 в остром периоде ишемического инсульта коррелирует с большим объемом инфаркта мозга и неблагоприятным прогнозом заболевания [3]. В другом исследовании показана связь отрицательной динамики инсульта с высокой концентрацией IL-6 вне зависимости от исходных размера, локализации и механизма инсульта [3]. Показатели IL-1 и IL-6 были изучены у больных инсультом в зависимости от степени тяжести заболевания. Так, у больных с тяжелой степенью инсульта концентрация ИЛ-lα в сравнении с нормой была снижена на 50,95 % (в 2,03 раза), а ИЛ-6 – на 85,49 % (в 6,89 раза) [4].
При исследовании концентрации IL-1β и IL-6 – в динамике острого периода церебрального инсульта мы получили следующие результаты (табл. 1).
Таким образом, мы отмечаем незначительное, но достоверное повышение концентрации изучаемых интерлейкинов, причем IL-1β максимально к концу острого периода, а IL-6 – к моменту завершения формирования инфаркта мозга (10 сут.).
Таблица 1
Содержание цитокинов в крови больных мозговым инсультом в динамике острого периода заболевания, пг/мл (Ме; 25-й; 75-й процентили)
|
Цитокины |
Клиническая группа, n = 78 |
Контрольная группа, n = 98 |
||
|
1-е сутки |
10-е сутки |
21-е сутки |
||
|
IL-1β |
0 (0; 0)×˅ |
1,09 (0; 12,16)* |
1,25 (0; 12,36)* |
0 (0; 0) |
|
IL-6 |
3,07*˅× (2,14; 5,46) |
8,2* (4,54; 28,99) |
6,72* (3,99; 14,37) |
1,62 (0,94; 2,9) |
Примечания: u,* – р < 0,0001 сравнение данных клинической и контрольной групп; u,× – р < 0,0001 статистически значимая разность с 21 сутками от начала инсульта; u, ˅ – р < 0,0001 сравнение с 10-ми сутками.
TLR могут экспрессироваться как внутриклеточно, так и экстрацеллюлярно. В роли лигандов для этих рецепторов могут выступать не только инфекционные патогены, но и эндогенные агенты (фрагменты разрушенных клеток) [2]. После связывания с лигандами рецепторы запускают иммунный ответ по MyD88-независимому пути, который осуществляется посредством адаптерного белка TRIF или MyD88, и впоследствии активирующие NF-кВ. Этот ядерный фактор, попадая в клеточное ядро, инициирует транскрипцию генов провоспалительных цитокинов IL-6, ФНО-а, IL-8, IL-18, хемокинов, NO-синтазы и других медиаторов, регулирующих воспаление. Также происходит активация цитокинов, стимулирующих дифференцировку Thl-клеток: IL-12, IL-23, IL-27, ответственных за развитие адаптивного иммунитета Тh1-типа [1].
Полиморфизм генов предполагает, что с одного и того же гена может быть скопировано несколько структурно отличающихся копий одного и того же белка. При этом часть скопированных вариантов или не обладает активностью, или может иметь противоположную функцию [8]. В случае с толл-рецепторами полиморфизм может приводить к нарушению распознавания лигандов и дисбалансу функционирования системы иммунитета [2]. Одним из наиболее изученных вариантов TLRs-полиморфизма является TLR4 (Asp299Gly), с которыми связывают отсутствие адекватного иммунного ответа и возрастание чувствительности к грамотрицательным инфекциям [8].
В результате молекулярно-генетического исследования обнаружены все искомые мутации в гомо- и гетерозиготном состоянии. Отклонение от равновесия Харди – Вайнберга выявлено как для полиморфизма TLR4(Asp299Gly) (χ2 = 25,6, р < 0,001), так и для TLR6(Ser249Pro) (χ2 = 9,97, р = 0,002) у больных инсультом, преимущественно за счет разницы наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности (табл. 2).
У больных отмечается более частое носительство нормального аллеля TLR4(Asp299Gly) – 0,79 против 0,69 в контроле, причем зарегистрировано 1,6-кратное преобладание носительства его в гомозиготном состоянии, гетерозиготное же состояние аллелей встречалось в 4,9 раза реже, чем у обследуемых контрольной группы. Степень риска развития изучаемого заболевания у носителей генотипа Asp/Asp составила 3,63 [CI 95 %: 2,11–6,24], у гетерозигот – 0,12 [CI 95 %: 0,06–0,23]. Таким образом, у носителей дикого аллеля RR составил 1,72 [CI 95 %: 1,14–2,6], для носителей мутантного аллеля – 0,58 [CI 95 %: 0,38–0,88].
Среди пациентов значительно чаще встречаются носители Pro/Pro-генотипа полиморфизма TLR6(Ser249Pro), для которых степень риска развития заболевания составляет 2,87 [CI 95 %: 1,68–4,89]. Носители дикого аллеля в гомозиготном состоянии преобладают среди здоровых резидентов, RR для развития инфаркта мозга составил 0,56 [CI 95 %: 0,30–1,07]. Таким образом, для обладателей нормального аллеля OR равен 0,47 [CI 95 %: 0,32–0,68], для носителей мутантного аллеля степень риска развития цереброваскулярной патологии составила 2,15 [CI 95 %: 1,46–3,16].
Таблица 2
Частота аллелей и генотипов TLR4(Asp299Gly), TLR6(Ser249Pro) у больных ишемическим инсультом в Забайкальском крае
|
SNP |
Группа |
Аллель |
Частота аллеля, р |
χ2; р |
Генотип |
Частота генотипа, % |
χ2; р |
|
TLR4 (Asp 299 Gly) |
клиническая группа (n = 128) |
–299Asp –299Gly |
0,79 0,21 |
6,66; 0,01 |
–299Asp/Asp –299Asp/Gly –299Gly/Gly |
74,6 10,2 15,2 |
46,3; < 0,0001 |
|
контрольная группа (n = 113) |
–299Asp –299Gly |
0,69 0,31 |
–299Asp/Asp –299Asp/Gly –299Gly/Gly |
44,2 49,6 6,2 |
|||
|
TLR6 (Ser 249 Pro) |
клиническая группа (n = 128) |
–249Ser –249Pro |
0,28 0,72 |
15,4; 0,0005 |
–249Ser/Ser –249Ser/Pro –249Pro/Pro |
15,4 21,1 63,5 |
15,3; 0,0005 |
|
контрольная группа (n = 113) |
–249Ser –249Pro |
0,46 0,54 |
–249Ser/Ser –249Ser/Pro –249Pro/Pro |
26,5 38,9 34,6 |
Примечание. χ2; р – статистически значимая разница между клинической и контрольной группами.
Таблица 3
Взаимосвязь носительства полиморфных вариантов толл-рецепторов с показателями IL-1β и IL-6 у больных мозговым инсультом (Ме; 25-й; 75-й процентили)
|
Группа |
TLR |
Генотип аллель |
1-е сутки от начала инсульта |
10-е сутки от начала инсульта |
21-е сутки от начала инсульта |
|||
|
IL-1β |
IL-6 |
IL-1β |
IL-6 |
IL-1β |
IL-6 |
|||
|
Клиническая группа |
TLR4 (Asp299Gly) |
Asp/Asp |
0 (0; 0) |
6,88 (4,06; 15,69)1,5 |
0 (0; 8,85)2 |
11,04 (5,26; 47,15)1,6 |
0 (0; 11,88) |
3,36(2,29; 5,6)1 |
|
Asp/Gly |
0 (0; 0)5 |
7,83 (3,29; 18)1 |
6,1 (2,68; 9,4)1 |
4,54 (2,63; 30,9)1 |
0 (0; 20,13) |
3,07 (2,34; 5,54) |
||
|
Gly/Gly |
0 (0; 0)5,6 |
4,92 (3,48; 8,26)1,6 |
9,68 (0; 18,95) |
6,62 (5,24; 17,77)1,6 |
2,5 (0; 6,66) |
2,68 (1,71; 3,46)2 |
||
|
Asp-аллель |
0 (0; 0) |
6,88 (4,06; 15,69)1,5 |
0 (0; 8,85)2 |
11,04 (5,26; 47,15)1,6 |
0 (0; 11,88) |
3,36 (2,29; 5,6)1 |
||
|
Gly-аллель |
0 (0; 0)5 |
4,92 (3,48; 8,26)1,6 |
8,58 (0; 14,63)1 |
6,14 (5,07; 13,8)1,6 |
2,5 (0; 6,66)2 |
2,68 (1,71; 3,46)2 |
||
|
TLR6 (Ser249Pro) |
Ser/Ser |
0 (0; 0)5 |
4,73 (3,92; 18,98)1,6 |
6,28 (1,34; 17,24)2 |
4,79 (2,85; 10,24)1 |
0 (0; 7,48) |
2,87 (2,68; 3,36) |
|
|
Ser/Pro |
0 (0; 0,46) |
6,56 (4,04; 11,31)1,5,6 |
0 (0; 8,85) |
11,04 (7,09; 193,7)1,3,6 |
2,5 (0; 12,02)2 |
2,87 (1,9; 4,66)2 |
||
|
Pro/Pro |
0 (0; 0)5,6 |
7,09 (3,69; 14,37)1,5,6 |
0 (0; 13,81)2 |
7,41 (4,54; 20,36)1,6 |
0 (0; 10,23) |
3,07 (2,14; 5,61)1 |
||
|
Ser-аллель |
0 (0; 0)5,6 |
4,73 (3,92; 18,98)1,5,6 |
6,28 (1,34; 17,24)2 |
4,79 (2,85; 10,24)1,6 |
0 (0; 7,48) |
2,87 (2,68; 3,36) |
||
|
Pro-аллель |
0 (0; 0) |
6,98 (3,98; 14,37)1,5,6 |
0 (0; 10,98)1 |
8,82 (4,68; 37,38)1,6 |
0 (0; 11,47)1 |
3,07 (2,04; 5,31)1 |
||
|
Контрольная группа |
TLR4 (Asp299Gly) |
Asp/Asp |
0 (0; 0,16) |
1,54 (0,94; 2,81)4 |
Не исследовали |
Не исследовали |
||
|
Asp/Gly |
0 (0; 0) |
1,83 (1,24; 3,77)4 |
||||||
|
Gly/Gly |
0 (0; 0) |
0,89 (0,52; 1,34)4 |
||||||
|
Asp-аллель |
0 (0; 0,16) |
1,54 (0,94; 2,81) |
Не исследовали |
Не исследовали |
||||
|
Gly-аллель |
0 (0; 0) |
1,79 (1,04; 3,6) |
||||||
|
TLR6 (Ser249Pro) |
Ser/Ser |
0 (0; 0) |
1,54 (0,99; 3,72) |
Не исследовали |
Не исследовали |
|||
|
Ser/Pro |
0 (0; 0) |
1,69 (1,02; 2,56) |
||||||
|
Pro/Pro |
0 (0; 0,11) |
1,64 (1,24; 2,93)3 |
||||||
|
Ser-аллель |
0 (0; 0) |
1,54 (0,99; 3,72) |
Не исследовали |
Не исследовали |
||||
|
Pro-аллель |
0 (0; 0) |
1,64 (1,04; 2,79) |
||||||
Примечания: u,1 – р < 0,01; u,2 – р < 0,05 – сравнение данных клинической и контрольной групп; u,3 – р < 0,05 – сравнение значений генотипов и аллелей между толл-рецепторами внутри группы; u,4 – р < 0,05 – сравнение данных генотипов и аллелей одного рецептора внутри группы; u,5 – р < 0,0001 сравнение с 10-ми сутками; u,6 – р < 0,0001статистически значимая разница с 21-ми сутками от начала инсульта.
При анализе ассоциации носительства изучаемых полиморфных маркеров и концентрации интерлейкинов у больных ишемическим инсультом отмечено, что у обладателей Pro-аллели TLR6 (Ser249Pro) и Pro/Pro TLR6 (Ser249Pro) определяется более высокий уровень IL-1β и IL-6. Gly-аллель TLR4 (Asp299Gly) ассоциируется с высокими значениями IL-1β, а Asp-аллель TLR4 (Asp299Gly) – с повышением в плазме IL-6 (табл. 3).
Мы предполагаем, что полиморфизм TLR4 (Asp299Gly) и TLR6 (Ser249Pro) приводит к генетически детерминированным конформационным изменениям рецепторов или изменениями передачи сигнала в клетку, что в свою очередь вызывает цитокиновый дисбаланс, влияющий на исход и течение ОНМК.
Заключение
В результате молекулярно-генетического исследования обнаружены все искомые мутации в гомо- и гетерозиготном состоянии. В сравнении с контрольной группой у больных мозговым инсультом в Забайкальском крае отмечено частотное преобладание генотипов TLR4-299Asp/Asp, TLR6-249Pro/Pro и аллелей TLR4-299Asp TLR6-249Pro. Gly-аллель TLR4 (Asp299Gly) и полиморфный вариант Pro/Pro TLR6 (Ser249Pro) у больных инсультом ассоциируются с высокими значениями IL-1β. У носителей Asp-аллели TLR4 (Asp299Gly) и у обладателей Pro-аллели TLR6 (Ser249Pro) среди участников клинической группы определился более высокий уровень IL-6. Таким образом, носительство полиморфизма изучаемых рецепторов предположительно увеличивает синтез IL-6 и IL-1β, от чего зависит выраженность и продолжительность воспалительного процесса в сосудистой стенке, а значит, течение и исход инсульта.