Из всех существующих на сегодняшний день методов ортопедического удлинения именно метод Г.А. Илизарова получил международное признание и широкое внедрение в практику, однако вплоть до настоящего времени при его применении остаётся нерешённой проблема функциональной реабилитации пациентов – в частности, восстановление объёма движений в суставах [1, 5].
С целью уменьшения травматизации тканей при дистракционном остеосинтезе академик Г.А. Илизаров предложил разделить суточное удлинение (1 мм) на несколько приёмов (разовых удлинений) – принцип дробной и высокодробной дистракции [4]. В условиях дозированной низкодробной дистракции с разовым удлинением 0,5 мм зарубежными исследователями [10, 12] были отмечены истончение, разволокнение суставного хряща, в части наблюдений выявлены некротические изменения. При применении автодистракторов, позволяющих распределить суточное удлинение на 120 приёмов, повреждения суставного хряща существенно уменьшаются [11]. Меньшая травматизация суставного хряща в условиях высокодробной дистракции установлена также при автоматическом удлинении с темпом 1 мм за 60 приёмов [9]. В настоящее время недостаточно изучено состояние суставного хряща при наиболее часто применяемом в клинике режиме ручной дистракции «1 мм за 4 приёма» с разовым удлинением 0,25 мм, отсутствуют исследования по сопоставлению этого режима с высокодробным режимом ручной дистракции «1 мм за 8 приемов» (величина разового удлинения 0,125 мм). Актуальность исследования структурной реорганизации суставного хряща при биомоделировании ортопедического удлинения конечностей и сопоставительного количественного анализа по единому алгоритму определяется недостаточными знаниями об адаптивности и пластичности хрящевой ткани в обозначенных условиях и необходимостью этих знаний для оптимизации методик реконструктивной ортопедии.
Цель исследования
Изучение зависимости количественных характеристик суставного хряща от условий удлинения смежного сегмента конечности с темпом 1 мм за 4 и 8 приёмов.
Материалы и методы исследования
Исследован суставной хрящ наружных мыщелков бедра 5 интактных (контроль) и 28 опытных собак, которым после закрытой флексионной остеоклазии в течение 28 суток удлиняли голень аппаратом Илизарова в 1-й серии (n = 16) с темпом 1 мм за 4 приема, во 2-й серии (n = 12) с темпом 1 мм за 8 приемов. Экспериментаторы д.м.н. С.А. Ерофеев и к.в.н. А.А. Еманов. Содержание, оперативные вмешательства и эвтаназию животных проводили в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения Российской Федерации к работе экспериментально-биологических клиник и принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986). Манипуляции, проводимые на животных, рассмотрены и одобрены этическим комитетом «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова». Гистоморфометрические и стереологические исследования проведены через 28 суток дистракции, 30 суток фиксации и 30 суток без аппарата по серийным полутонким срезам увеличенной (6–8 мм2) площади [7, 8], окрашенным метиленовым синим и основным фуксином. Цифровые изображения получали с помощью АПК «ДиаМорф» (Москва) на фотомикроскопе «Оpton» (Германия). В графическом редакторе «ВТ-Мастер-Морфология» («ВидеоТест», С-Пб) измеряли толщину (h, мкм) хряща, рассчитывали долю хондроцитов в составе изогенных групп (NNis.gr., %) от общего количества хондроцитов и долю пустых лакун (NNem.lac., %) от общего количества лакун. В поверхностной, промежуточной и глубокой зонах хряща регистрировали объемную (VVch, %) и численную (NAch, мкм-2) плотности клеток, площадь хондроцитов (Sch, мкм2). В этих же клетках определяли объемную плотность ядер (VVn) и цитоплазмы (VVc) в долях единицы, а также их отношение (VVn/ VVc ) – ядерно-цитоплазматический индекс (NCI). Для анализа цифрового материала использовали описательную статистику. В зависимости от характера распределения и объема выборки достоверность различий оценивали с помощью критериев Стьюдента или Вилкоксона в программе AtteStat, версия 1.0 в электронных таблицах Microsoft Excel 97. Для исследования в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) «JSM-840» (Jeol, Япония) образцы суставного хряща с подлежащей субхондральной костью дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации, пропитывали в камфене (3,3-диметил- 2-метиленбицикло[2,2,1]гептан – ГОСТ 15039-76) по оригинальной методике [6], высушивали на воздухе, напыляли серебром.
Результаты исследования и их обсуждение
К концу дистракции в обеих сериях при исследовании в СЭМ отмечено разволокнение суставной поверхности, вскрытые клеточные лакуны (рис. 1). Наиболее интенсивные деструктивные изменения (разволокнение коллагенового каркаса поверхностной зоны) отмечены в серии 1.
В обеих сериях при исследовании полутонких срезов хряща деструктивно измененные хондроциты были выявлены во всех зонах, но наибольшая частота встречаемости отмечена в поверхностной и глубокой.
Морфометрический анализ комплекса параметров позволил уточнить различия в состоянии суставного хряща при ручной дистракции с темпом 1 мм за 4 и 8 приемов. К концу периода дистракции в 1-й серии отмечено достоверное (р < 0,001) увеличение h хряща относительно контроля (таблица), что обусловлено более выраженной дезорганизацией межклеточного вещества поверхностной зоны, набуханием основного вещества и коллагеновых волокон. На последующих этапах эксперимента выявлено достоверное (р < 0,001) снижение анализируемого параметра относительно контроля и 2-й серии эксперимента. Во 2-й серии к концу периода дистракции h хряща достоверно (р < 0,001) ниже контроля. На последующих этапах эксперимента выявлена тенденция к увеличению, через месяц после снятия аппарата h хряща сопоставима с контролем.
В поверхностной зоне через 28 суток дистракции NAch в серии 1 достоверно (p < 0,05) снижена, относительно контроля и серии 2, к концу эксперимента достоверно превышала контроль и значения серии 2 (таблица).
В серии 2 к концу эксперимента сохранялись сниженные значения NAch. В срок 30 суток фиксации в серии 1 VVch незначительно увеличивалась относительно предыдущего срока, но к концу эксперимента сохранялись достоверно (p < 0,05) сниженные значения. В серии 2 значения VVch через месяц фиксации и месяц после снятия аппарата сопоставимы с контролем (таблица). Низкие значения объемной плотности хондроцитов в серии 1 на фоне высокой численной плотности обусловлены резким снижением Sch (таблица). На всех этапах эксперимента в поверхностной зоне хряща 2-й серии выявлено снижение (p < 0,05) NCI (0,54 ± 0,03 через 28 суток дистракции; 0,35 ± 0,03 через 30 суток фиксации; 0,64 ± 0,03 через 30 суток баз аппарата; 0,75 ± 0,03 в контроле). В серии 1 снижение (p < 0,05) NCI выражено в меньшей степени, чем в серии 2 (0,64 ± 0,02 через 28 суток дистракции; 0,61 ± 0,05 через 30 суток фиксации и через 30 суток баз аппарата). Снижение параметров VVch, Sch в серии 1 к концу эксперимента может являться отражением деструктивных изменений хондроцитов, апоптоза. Самым ранним морфологическим проявлением апоптоза является появление в ядре резко очерченных уплотненных масс хроматина с внутренней стороны ядерной оболочки [2]. Морфологические признаки апоптоза чаще наблюдали в суставном хряще серии 1, при исследовании в СЭМ отмечены явления сжатия клеток с сохранением контактов с межклеточным матриксом (рис. 2, А).
А Б
Рис. 1. СЭМ, поверхность, обращенная в полость сустава. Конец периода дистракции. А – 1 серия, увеличение 850, Б – 2 серия, увеличение 500
Количественные характеристики суставного хряща мыщелка бедра на этапах эксперимента удлинения голени
|
Параметры |
VVch ( %,М ± σ) |
NAch (мкм-2,M ± σ) |
Sch (мкм2,M ± σ) |
h (мкм, M ± m) |
NNem.lac. ( %) |
NNis.gr. ( %) |
|
|
Контроль |
|||||||
|
Контроль |
I |
6,12 ± 2,43 |
8,21 ± 2,19 |
45,34 ± 10,51 |
475,55 ± 1,31 |
13,6 |
14,5 |
|
II |
8,75 ± 2,54 |
4,45 ± 1,34 |
119,91 ± 24,37 |
||||
|
III |
12,26 ± 3,21 |
5,73 ± 2,15 |
129,31 ± 28,14 |
||||
|
1 мм за 4 приема (ручные подкрутки) |
|||||||
|
28 суток дистракции |
I |
3,42 ± 1,96* |
5,42 ± 1,68* |
44,23 ± 12,98 |
710,34 ± 7,16 * |
29,97 * |
24,7 * |
|
II |
3,9 ± 0,68* |
4,94 ± 1,33 |
53,64 ± 10,38* |
||||
|
III |
4,99 ± 1,18* |
4,91 ± 1,56* |
70,81 ± 19,45* |
||||
|
30 суток фиксации |
I |
4,12 ± 1,26* |
11,5 ± 3,44* |
29,53 ± 7,15* |
421,15 ± 4,82 * |
20,85 * |
20,18 * |
|
II |
4,67 ± 1,04* |
6,3 ± 1,44* |
71,13 ± 18,36* |
||||
|
III |
6,58 ± 1,43* |
6,51 ± 1,15* |
80,75 ± 14,13* |
||||
|
30 суток без аппарата |
I |
4,14 ± 0,97* |
12,21 ± 2,62* |
27,75 ± 4,32* |
416,94 ± 4,37 * |
21,12 * |
15,4 * |
|
II |
6,01 ± 1,39* |
7,13 ± 2,68* |
66,61 ± 15,01* |
||||
|
III |
6,91 ± 1,97* |
3,84 ± 2,64* |
103,25 ± 29,92* |
||||
|
1 мм за 8 приемов (ручные подкрутки) |
|||||||
|
28 суток дистракции |
I |
3,73 ± 1,62* |
7,75 ± 1,79*■ |
30,09 ± 6,65*■ |
369,91 ± 2,57 *■ |
20,4 *■ |
21,14 *■ |
|
II |
6,41 ± 2,34*■ |
5,94 ± 1,56*■ |
68,71 ± 16,33*■ |
||||
|
III |
9,06 ± 3,85*■ |
6,01 ± 1,49*■ |
96,86 ± 30,14*■ |
||||
|
30 суток фиксации |
I |
6,32 ± 2,43■ |
7,92 ± 2,39*■ |
52,73 ± 18,44*■ |
415,38 ± 2,13 *■ |
19,7 * |
31,2 *■ |
|
II |
9,22 ± 3,18*■ |
5,68 ± 1,84*■ |
102,34 ± 19,74*■ |
||||
|
III |
9,16 ± 3,27*■ |
6,36 ± 2,08* |
90,94 ± 23,66*■ |
||||
|
30 суток без аппарата |
I |
6,53 ± 2,12■ |
4,59 ± 1,19*■ |
71,02 ± 21,61*■ |
468,24 ± 0,53 ■ |
15,8 *■ |
33,5 *■ |
|
II |
8,71 ± 1,68■ |
4,53 ± 1,12■ |
121,71 ± 22,35■ |
||||
|
III |
8,50 ± 1,34*■ |
4,87 ± 1,28*■ |
116,11 ± 33,18*■ |
||||
Примечания. I – поверхностная, II – промежуточная, III – глубокая зоны хряща.
* – достоверные различия с контролем, ■ – достоверные различия между сериями (для параметров VVch, NAch, NNem.lac, NNis.gr и Sch – р < 0,05, для h – р < 0,001).
А Б
Рис. 2. Хондроцит в лакуне. СЭМ. А – увеличение 5500. Серия 1. Б – увеличение 4300. Серия 2. Многочисленные отростки (О) контактируют со стенкой лакуны. Стенки лакуны построены из коллагеновых фибрилл (Кф)
В серии 2 увеличение размеров клеток, снижение NCI свидетельствовали о повышении синтетической активности хондроцитов поверхностной зоны, при исследовании в СЭМ отмечали хондроциты, которые занимали всю клеточную лакуну, поверхность таких клеток имела бугристый рельеф, многочисленные отростки контактировали со стенкой лакуны, фиксируя положение клетки (рис. 2, Б).
В промежуточной зоне в обеих сериях на всех сроках эксперимента численная плотность клеток превышала контрольные значения, максимальные значения были выявлены в серии 1 в сроки 30 суток фиксации и месяц после снятия аппарата (таблица). В обеих сериях к концу периода дистракции выявлено уменьшение VVch, в серии 1 значения минимальные (таблица). Снижение VVch обусловлено уменьшением Sch в обеих сериях, наиболее выраженным в 1 серии. Через месяц фиксации в обеих сериях отмечена тенденция к увеличению VVch, наиболее выраженная во 2-й серии. К концу эксперимента значения VVch в серии 2 достигали контроль, в серии 1 достоверно (p < 0,05) ниже контроля. При 4-кратной дистракции отмечено достоверное (p < 0,05) увеличение Vvn, в результате чего NCI на всех этапах эксперимента превышал (p < 0,05) контроль (0,74 ± 0,04 через 28 суток дистракции; 0,34 ± 0,03 через 30 суток фиксации; 0,32 ± 0,03 через 30 суток без аппарата; 0,27 ± 0,02 в контроле). При 8- кратной дистракции значения NCI к концу дистракции увеличивались (0,32 ± 0,01), через месяцев фиксации за счет увеличения в большей степени Vvс снижались до 0,24 ± 0,01, к концу эксперимента вновь увеличивались до 0,34 ± 0,02. Выявленная динамика количественных характеристик клеток и их ядер промежуточной зоны суставного хряща в серии 1 может являться отражением дедифференцировки клеток и восстановления их пролиферативных потенций. Известно, что дедифференцировка, как реактивно-приспособительное изменение клеток, сопровождается увеличением относительных объемов ядер [3]. Так, к концу периода дистракции доля изогенных групп и доля пустых лакун в общем объеме выборки в 1-й серии превышала контроль и значения серии 2 (таблица). Значения доли пустых лакун в общем объеме выборки в этой серии максимальны. При некрозе происходит разрушение мембранного скелета с выходом ее содержимого в окружающее пространство, в том числе и факторов роста, тем самым в биологическом феномене некроза уже заложен фактор будущей регенерации [2]. Чем, возможно, объясняются интенсивно выраженные процессы гибели и пролиферации в серии 1. К концу эксперимента в обеих сериях сохранялись повышенные значения NNis.gr, максимальные значения отмечены в серии 2.
В глубокой зоне во 2-й серии NAch превышала контроль (таблица), за счет увеличения количества клеток в колонках, формирования изогенных групп, вокруг которых территориальный матрикс отсутствовал. В 1-й серии значения данного параметра значимо снижены. При светооптическом исследовании полутонких срезов выявлено изменение цитоархитектоники глубокой зоны, отсутствовало колончатое расположение клеток, появлялись бесклеточные поля, часть хондроцитов в состоянии деструкции, выявлены пустые лакуны. Через месяц фиксации NAch в обеих сериях достоверно (p < 0,05) превышала контроль, к концу эксперимента выявлена тенденция к снижению данного параметра, минимальные значения зарегистрированы в серии 1. В обеих сериях VVch на всех этапах эксперимента снижена, минимальные значения отмечены в серии 1. Низкие значения VVch обусловлены резким снижением Sch, интенсивнее выраженным в серии 1 (таблица). Значения NCI в серии 1 на этапах дистракции (0,24 ± 0,02) и через 30 суток фиксации (0,26 ± 0,02) сопоставимы с контролем (0,25 ± 0,02), в срок 30 суток без аппарата (0,17 ± 0,01) за счет увеличения Vvс снижены (p < 0,05). В серии 2 на этапе дистракции и в конце эксперимента значения NCI увеличивались (0,32 ± 0,02 и 0,27 ± 0,02 соответственно), а в срок 30 суток фиксации (0,21 ± 0,01) незначительно снижались.
Степень травматизации суставного хряща характеризует увеличение NNem.lac., что выявлено в обеих сериях, максимальные значения данного параметра зарегистрированы в 1-й серии через 28 суток дистракции, различия между сериями достоверны (таблица). При этом размерные характеристики хондроцитов в серии 1 более снижены по сравнению с контролем и серией 2. На последующих этапах эксперимента в серии 2 интенсивнее выражены процессы пролиферации (высокие значения NNis.gr), а увеличение к концу эксперимента параметров h хряща, VVch, Sch, характеризовало повышение биосинтетической активности хондроцитов.
Заключение
Таким образом, степень выраженности изменений в суставном хряще зависела от характеристик дистракции. Так, при режиме «1 мм за 4 приема» высокая интенсивность деструктивных процессов, вероятно, связана с большей (0,25 мм), чем при режиме «1 мм за 8 приемов» величиной одномоментного удлинения (0,125 мм). Сопоставительный анализ комплекса количественных параметров суставного хряща показал, что к концу дистракции при режиме «1 мм за 4 приема» более выражена деструктивно-пролиферативная реакция суставного хряща, чем при режиме «1 мм за 8 приемов». Параллельно в хряще развиваются регенераторные процессы, наиболее выраженные в периодах фиксации и после снятия аппарата. Сравнивая течение восстановительного процесса, можно отметить, что при более дробной дистракции в режиме «1 мм за 8 приемов» восстановление структуры суставного хряща протекает наиболее интенсивно.