Биопленкообразующие штаммы коагулазоотрицательных стафилококков являются основной причиной инфекционно-воспалительных осложнений в хирургических стационарах и отделениях интенсивной терапии [5, 11].
Зачастую, стандартные методы антибактериального лечения направлены на планктонные клетки, тогда как биопленкообразующие стафилококки способны к диссеминации с формированием очагов хронической персистирующей инфекции.
Стафилококки используют широкий спектр стратегий для колонизации абиотических поверхностей, как с помощью специфического связывания с поверхностями, покрытыми сывороточными белками или внеклеточной ДНК [6], так и с помощью собственных поверхностных пептидов [8].
Поэтому одним из направлений поиска эффективных препаратов, предотвращающих биопленкообразование, являются исследования веществ, блокирующих связывание с абиотической поверхностью, вызывающих «антиадгезивный эффект».
Взаимодействие бактерий с абиотической поверхностью носит неспецифический [12], гидрофобный характер [4], а эффективность адгезии зависит как от физико-химических свойств поверхности, так и от физико-химических свойств (гидрофильно-липофильного баланса и электрокинетического потенциала) бактерий [2].
Однако, несмотря на то, что в ряде публикаций [7, 9] говорится о сочетанном антибактериальном эффекте тромбоцитарных низкомолекулярных пептидов, в доступной нам литературе не найдены сведения об их влиянии на биопленкообразование, кинетику роста и физико-химические свойства КОС.
В связи с этим целью исследования явилось изучение влияния антимикробных тромбоцитарных пептидов на физико-химические свойства коагулазоотрицательных стафилококков и их способность формировать биопленки.
Материалы и методы исследования
Материалом исследования послужили 43 культуры коагулазоотрицательных стафилококков (S. haemolyticus, n = 24; S. epidermidis, n = 7; S. hominis, n = 12) из коллекции ИКВС УрО РАН. Идентификацию штаммов микроорганизмов проводили на основании общепринятых методов по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам, с использованием стандартных систем «StaphyTest» (LaChema, Чехия).
В работе был использован лиофилизированный препарат, содержащий смесь антимикробных пептидов из тромбоцитов человека (hPL), получаемый из тромбоконцентрата, содержащего 0,55×1011 тромбоцитов. Препарат подвергали 3-кратному замораживанию (– 110 °С), оттаиванию (+ 3 °С – + 5 °С) и центрифугировали при 1000 g в течение 30 минут, надосадок профильтровали через мембранные фильтры Durapore 0,22 мкм и лиофилизировали.
Электрофорез в ПААГ в присутствии ДДС-Na показал, что комплексный препарат тромболизата (hPL) содержал белки с молекулярной массой в области 60–70 кДа, белки с массой 20–25 кДа и низкомолекулярные пептиды с массой 7,61–10,47 кДа.
Образование биопленок стафилококками изучали с помощью фотометрического метода [10]. Стафилококки выращивали в 150 мкл мясопептонного бульона (МПБ) в 96-луночной полистироловой(гидрофильной) планшете в течение 24 ч при 37 °С, после чего удаляли из лунок планктонные клетки и окрашивали биопленки 1 %-ым раствором кристаллвиолета. Промывали лунки дист. водой и вносили в них смесь C2H5OH/CH3COOH (9:1). С помощью фотометра Multiscan ascent (Thermo Electron Co., China) замеряли оптическую плотность (OD) надосадочной жидкости при длине волны (λ) 570 нм. Интенсивность окрашивания соответствовала степени пленкообразования исследуемых культур стафилококков.
Для оценки степени гидрофобности стафилококков использовали метод разделения взвеси клеток в двухфазной системе «жидкость-жидкость» с несмешивающимися водными фазами в 15 М растворе NaCl, обогащенными полиэтиленгликолем (PEG 6000; с концентрацией 4,5 %) и декстраном (Т500; с концентрацией 6,2 %) [1].
Измерение электрокинетического потенциала (дзета-потенциала, mV) клеток стафилококков осуществляли амплитудно-частотным методом, с использованием Дзетометра-1М (Россия) в обычном режиме его работы (напряжение – 10 В, частота – 0,2 Гц), путем измерения амплитуды колебаний 50 бактериальных клеток в микроэлектрофоретической камере (размеры: 22×22 мм, высота 0,2 мм) и вычисления средних значений дзета-потенциала для штамма по аппроксимированной формуле Смолуховского [2].
Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке методами вариационной статистики и корреляционного анализа [3].
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что из всей выборки клинических изолятов в 88,4 % случаев стафилококки обладали способностью образовывать биопленки.
Биопленкообразующие коагулазоотрицательные стафилококки были гидрофильнее (– 1,33 ± 0,11 о.е., в сравнении с – 0,93 ± 0,27 о.е.; p < 0,05) и достоверно не отличались, от необразующих биопленки стафилококков, по электрокинетическому потенциалу (– 33,4 ± 0,4 mV; -33,3 ± 1,0 mV; соответственно).
Инкубация биопленкообразующих стафилококков с лиофилизированным препаратом тромбоцитарного лизата (hPL) приводила к снижению количества жизнеспособных бактерий (МИК50 = 4 мг/мл).
Пародоксально, но процент жизнеспособных коагулазоотрицательных стафилококков при инкубации с субингибиторными (2–4 мг/мл) концентрациями тромбоцитарного лизата (hPL) был ниже (2 мг/мл – 15,5 ± 1,0 % КОЕ; 4 мг/мл – 12,1 ± 2,4 % КОЕ), чем при инкубации стафилококков с более высокими концентрациями тромбоцитарного лизата (6 мг/мл – 16,1 ± 1,1 % КОЕ; 8 мг/мл – 16,1 ± 1,2 % КОЕ; 10 мг/мл – 24,5 ± 0,8 % КОЕ). Даже при 5-кратном превышении МИК50 (20 мг/мл), из инкубационной системы высевались резистентные к антимикробным тромбоцитарным пептидам стафилококки.
Исследование физико-химических свойств, резистентных к антимикробным тромбоцитарным пептидам коагулазоотрицательных стафилококков, показало, что они обладали высокой гидрофильностью поверхности (– 1,46 ± 0,12 о.е., в сравнении с нативными бактериями – 1,33 ± 0,11 о.е.), высокими значениями электрокинетического потенциала (– 37,2 ± 0,3 mV, в сравнении с нативными бактериями – 33,4 ± 0,4 mV, p < 0,05) и меньшей способностью формировать биопленки (0,53 ± 0,04, соответственно 0,74 ± 0,06).
С целью определения эффективности влияния антимикробных пептидов тромбоцитарного лизата (hPL) на кинетику роста КОС, определения величины и направленности изменения физико-химических свойств у резистентных к антимикробным тромбоцитарным пептидам коагулазоотрицательных стафилококков было отобрано 12 биопленкообразующих культур S. hominis.
Предынкубация стафилококков с субингибиторными (2–4 мг/мл) концентрациями тромбоцитарного лизата (hPL) способствовала снижению максимальной удельной скорости роста (m = 0,08 ч-1; в сравнении с интактными бактериями – m = 0,27 ч-1) и запаздыванию ее наступления на 60 минут. При более высоких концентрациях тромбоцитарных пептидов (6–10 мг/мл) отмечалось подавление и десинхронизация роста биопленкообразующих S. hominis.
Устойчивые к антимикробным тромбоцитарным пептидам (4 мг/мл) S. hominis были гидрофильнее и имели более высокие значения электрокинетического потенциала, как в начале экспоненциального роста (– 0,87 ± 0,08 о.е.; – 34,0 ± 0,4 mV, в сравнении с нативными бактериями – 0,53 ± 0,6 о.е.; – 31,9 ± 0,3 mV), так и в конце экспоненциального роста (– 1,26 ± 0,07 о.е.; – 36,0 ± 0,4 mV, в сравнении с нативными бактериями – 1,01 ± 0,06 о.е.; – 34,3 ± 0,3mV).
Представленные в работе данные свидетельствуют о том, что влияние антимикробных пептидов тромбоцитарного лизата на биопленкообразующие КОС не ограничивается лишь бактерицидным эффектом. Инкубация стафилококков с антимикробными тромбоцитарными пептидами способствует селекции резистентного бактериального фенотипа, о чем свидетельствуют как изменение физико-химических свойств стафилококков (гидрофилизация поверхности и повышение электрокинетического потенциала), так и снижение биопленкообразования.
Полученные материалы открывают перспективы для дальнейшего изучения комплексного препарата и его компонентов, содержащих антимикробные тромбоцитарные пептиды, не только в качестве антимикробного средства, но и как препарата, ингибирующего биопленкообразование.