Scientific journal
Advances in current natural sciences
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,775

SYNTHESIS AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF SUPRAMOLECULAR SYSTEMS BASED ON PHTHALOCYANINE COBALT (II)

Bichan N.G. 1 Ovchenkova E.N. 1 Garasko E.V. 2 Klyueva M.E. 2
1 G.A. Krestov Institute of Solution Chemistry of the Russian Academy of Sciences
2 Ivanovo State Medical Academy
The formation of the supramolecular systems based on donor-acceptor complex between the highly substituted (phthalocyaninato)cobalt(II) and pyridine/pyrazine (Py)/(Pyz) was studied by spectrophotometric method. The reaction product compositions were 1:1. The modification of a polypropylene film by applying the synthesized compounds in order to identify their antimicrobial activity against Gram-positive (Staphylococcus aureus), Gram-negative (Escherichia coli) bacteria and yeastlike fungi (Candida albicans) was carried out. It was shown that the supramolecular systems under investigation exhibit antibacterial activity against Staphylococcus aureus at the preliminary UV radiation (365 nm) of the modified films.
cobalt phthalocyanine
pyridine
pyrazine
polypropylene films
supramolecular sustems
antimicrobial activity
gram positive and gram negative bacteria
yeastlike fungus

В последние годы в связи с ростом резистентности многих бактерий и вирусов к известным антимикробным препаратам заметно вырос интерес к разработке новых супрамолекулярных систем, обладающих антимикробными свойствами [1–5]. Поиск новых стратегий борьбы с микроорганизмами, обладающими множественной лекарственной устойчивостью, является актуальной задачей. Многие авторы представляют фотодинамическую инактивацию микроорганизмов одним из перспективных альтернативных подходов в этой области, число исследований и публикаций в которой растет с каждым годом. В качестве фотосенсибилизирующих агентов в этих случаях используют макрогетероциклические соединения и их комплексы [13]. Авторы работы [11] показали антибактериальную активность фталоцианинов кобальта против патогенных бактерий Xanthomonas citri и Xanthomonas Compstris. В работе [10] исследовано антимикробное действие протопорфирина кобальта против золотистого стафилококка.

Цель исследования. Синтез супрамолекулярных донорно-акцепторных аксиальных комплексов (окта(3,5-ди-трет-бутилфенокси)фталоцианинато) кобальта (II) с биоактивными органическими основаниями (пиридин, пиразин), модификация поверхности полипропиленовой пленки (ПП) синтезированными соединениями и выявление их антибактериальной/противогрибковой активности.

Материалы и методы исследования

(Окта(3,5-ди-трет-бутилфенокси)фталоцианинато)кобальта (II) CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 (рис. 1) был синтезирован по реакции между ацетатом кобальта (II) и соответствующим органическим лигандом (H2Pc(3,5-di-tBuPhO)8) в кипящем диметилформамиде и очищен колоночной хроматографией (силикагель/CH2Cl2). ЭСП (толуол) λmax nm (lg ε): 304 (4,76); 340 (4,72); 607 (4,45); 646 (4,53); 673 (5,17). ИК спектр (KBr), ν, cm–1: 2964, 2905, 2868, 1608, 1588, 1524, 1457, 1415, 1363, 1348, 1297, 1274, 1246, 1198, 1145, 1095, 1052, 961, 903, 864, 836, 756, 726, 707. 1H ЯМР (400 MHz; δ, ppm; CDCl3): δ = 8,94 (s, 8 H), 8,03 (s, 8 p-H), 7,29 (s, 16 o-H), 1,35 (s, 144 tert-butyl-H) ppm. Найдено: C 76,79; H 7,47; N 5,23 %; C144H176N8O8Co вычислено: C 78,4; H 8,04; N 5,08 %. Масс спектр (MALDI-TOF): m/z = 2203 [M]+.

Реакция аксиальной координации CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 с органическими основаниями (L = Py, Pyz) была изучена при 298 K в толуоле спектрофотометрически, использовался метод молярных отношений. Готовили серию растворов в толуоле с постоянной концентрацией фталоцианинового комплекса (5,0•10–6 моль/л) и различными концентрациями органического основания (0–0,56 моль/л).

pic_30.tif

Рис. 1. Структурные формулы CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 (а), пиридина (б) и пиразина (в)

Константы устойчивости донорно-акцепторных комплексов (Kу) определяли по уравнению (1) для трехкомпонентной равновесной системы:

bichan001.wmf (1)

где bichan002.wmf, bichan003.wmf – начальные концентрации органического основания и CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 в толуоле соответственно; А0, Аi, А∞ – оптические плотности при рабочей длине волны для фталоцианина кобальта, равновесной смеси при определенной концентрации молекулярного лиганда и аксиального донорно-акцепторного комплекса. Количество присоединяемых молекул органического основания определяли как тангенс угла наклона прямой lgI – lgCL где I – индикаторное отношение, определяемое по уравнению I = (Ai – A0)/(A∞ – Ai).

Концентрации растворов аксиальных комплексов фталоцианина кобальта с основанием для модификации полипропиленовой пленки соответствовали условиям окончания титрования исходного фталоцианина кобальта раствором органического основания (в точках эквивалентности).

Оценку биоцидного эффекта осуществляли по воздействию модифицированной синтезированными супрамолекулярными комплексами CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 с биоактивными основаниями полипропиленовой пленки (ПП) на грамположительные (Staphylococcus aureus), грамотрицательные (Escherichia coli) бактериальные культуры, а также дрожжеподобные грибы рода кандида (Candida albicans) на плотных и в жидких питательных средах.

Для проведения эксперимента был использован традиционный метод оценки антимикробной активности пленок. Пленки были помещены на поверхность плотных питательных сред в чашках Петри, засеянных «методом газона» испытуемым тест-микробом. После 24-часового термостатирования при температуре 37 °С определяли величину зоны задержки роста вокруг образцов пленок. Испытания образцов пленок в жидкой питательной среде включали учет роста бактерий и грибов через 24 часа инкубации пробирок с мясопептонным бульоном (МПБ), тест-культурой и образцом пленки в термостате при 37 °С. Определяли изменение мутности среды в сравнении с контролем, с последующим высевом микроорганизмов из жидкой питательной среды на чашки Петри с плотными питательными средами, их инкубацией в термостате при 37 °С 24 часа и подсчетом колониеобразующих единиц – КОЕ. Кроме того, количество выросших микроорганизмов оценивали спектрофотометрически по изменению мутности раствора, которая увеличивалась/уменьшалась при росте/гибели микроорганизмов. Затем на основании сравнения оптической плотности растворов определяли процент роста культуры.

Испытанию подвергали исходную полипропиленовую пленку и пленку, обработанную испытуемыми супрамолекулярными системами. Проявление антимикробных свойств исследуемых образцов изучали как при обычном освещении, так и при действии УФ облучения (365 нм) в течение 2 минут (антимикробная фотодинамическая терапия).

Результаты исследования и их обсуждение

Электронная абсорбционная спектроскопия является наиболее удобным и распространенным методом для изучения процессов координации органических молекул на макрогетероциклических комплексах металлов. Образование аксиальных комплексов за счет донорно-акцепторного взаимодействия металл – донорный атом органического основания сопровождается смещением и изменением интенсивности основных полос в ЭСП комплекса.

Реакция CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 с пиридином и пиразином изучена в широком диапазоне концентраций оснований. Молекулы Py и Pyz обладают, наряду с σ-донорными, π-акцепторными свойствами и хорошо совмещаются с фталоцианиновым макроциклом в одной координационной сфере, что предопределило выбор органических биоактивных оснований. Кроме того, пиридин является структурным фрагментом ряда биологически активных соединений – витаминов, антибиотиков, алкалоидов, продуктов метаболизма. Пиразин и его производные обладают гербицидной и антибиотической активностью. Пиразиновый цикл входит в состав некоторых феромонов, антибиотиков (аспергилловая кислота), антивирусных, антибактериальных, противоопухолевых (эхиномицин) лекарственных препаратов.

При добавлении органического основания к толуольному раствору CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 в ЭСП наблюдается постепенное уменьшение интенсивности и гипсохромный сдвиг длинноволновой полосы. В случае координации Py величина сдвига Q-полосы составляет 9 нм, а в случае Pyz – 1 нм (рис. 2). Как видно из рис. 2, ЭСП продуктов реакции не претерпевают принципиальных изменений и по-прежнему характеризуют координированный кобальтом (II) макроциклический хромофор. Установленная экспериментально обратимость спектральных изменений свидетельствует о протекании реакции CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 с пиразином и пиридином до состояния равновесия. По тангенсу угла наклона линейной зависимости lgI от lgcL (рис. 3) определено число присоединившихся лигандов. Образовавшиеся в ходе реакции соединения представляют собой супрамолекулярные донорно-акцепторные комплексы состава 1:1.

pic_31.tif

Рис. 2. Электронные спектры поглощения CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 в толуоле (1), в смеси толуол-пиразин (СPyz = 0,56 моль/л) (2) и толуол-пиридин (СPy = 0,49 моль/л) (2)

pic_32.tif

Рис. 3. Зависимости lgI от lgCL для реакции CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 с пиразином (1) и пиримидином (2)

Полученные данные позволяют описать изучаемую реакцию уравнением

bichan004.wmf (2)

Константы устойчивости CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 с пиридином и пиразином, рассчитанные по уравнению (1), составляют (3,42 ± 0,47)•103 и (4,63 ± 0,9)•102 л/моль соответственно.

Образование донорно-акцепторных комплексов CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 с Py и Pyz подтверждено данными ИК и 1Н ЯМР спектроскопии. В ИК спектре продукта реакции (2) наблюдается высокочастотный сдвиг интенсивных полос изоиндольных фрагментов фталоцианина кобальта в области 1440–1450 см–1. Эти спектральные изменения в результате координации органического основания с кобальтфталоцианином разумно связать с выходом Со из плоскости макроцикла. Такие внеплоскостные смещения должны будут внести изменения в перекрывание dπ-орбиталей металла и еg*-орбиталей фталоцианина, приводя к изменениям энергии колебаний изоиндольных фрагментов фталоцианина. В ИК спектрах (Py)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 и (Pyz)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 наблюдаются также новые полосы, соответствующие колебаниям координированного пиридина (при 1742, 1492, 1408, 1216, 801, 779, 735, 518 см–1) и координированного пиразина (при 1737, 881, 807), частоты которых смещены примерно на 5–20 см–1 по сравнению с чистым Py и Pyz [7] соответственно. Новые сигналы при 397 и 464 см–1 соответствуют связи Co-NPy [12].

Диамагнитный комплекс CoPc(3,5di-tBuPhO)8 имеет спектр 1H ЯМР с четко разделенными сигналами протонов бензольных остатков и 3,5-ди-трет-бутильных групп в области от 8,94 до 7,29 ppm и 1,35 ppm. Введение в раствор комплекса в CDCl3 пиридина сопровождается появлением двух новых относительно узких сигналов пиридинового кольца при 7,7 и 7,4 ppm, которые претерпевают небольшой сильнопольный сдвиг по сравнению с сигналами некоординированного пиридина [8]. Наиболее заметно влияние на сигналы расположенных близко к макроциклу протонов изоиндольных групп. В спектре CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 протоны изоиндольных групп проявляются в виде синглета с химическим сдвигом 8,94 ppm. Для комплекса с пиридином данные протоны проявляются в виде уширенного синглета в области 8,86 ppm. Сигналы пара-протонов фенильных колец претерпевают лишь небольшой сильнопольный сдвиг, тогда как сигналы орто-протонов фенильных групп не смещаются, возможно, по причине расположения фенильных колец вне плоскости макроцикла. Аналогичные изменения наблюдаются и при координации пиразина.

(Окта(3,5-ди-трет-бутилфенокси)фталоцианинато)кобальт (II) и донорно-акцепторные супрамолекулы на его основе были нанесены на полипропиленовые пленки с целью исследования их актибактериальных/противогрибковых свойств. В результате испытаний образцов пленок на плотной питательной среде установлено, что исследуемые образцы пленок не подавили рост тест-культур Staphylococcus аureus, Escherichia coli и грибов Candida albicans. Зон задержки роста вокруг образцов не выявлено, что связано в первую очередь с тем, что синтезированные соединения не растворимы в водных средах и не мигрируют в окружающую среду. Можно говорить лишь о факте задержки роста тест-культур под некоторыми образцами.

Результаты испытаний образцов в жидких питательных средах с последующим высевом демонстрируют данные, полученные при испытаниях на плотных питательных средах (сплошной рост тест-культур – 1000 КОЕ/мл – посевная доза) в отношении Escherichia coli и грибов Candida albicans. В отношении Staphylococcus aureus выявлено отсутствие роста у образца полипропиленовой пленки, модифицированной супрамолекулярным комплексом (Pyz)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 и минимальный рост (45 КОЕ) в случае образца (Py)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 при их предварительном облучении (рис. 4).

Следующим этапом исследования антибактериальной/противогрибковой активности являлась оценка с помощью счетного спектрофотометрического метода. На основании сравнения оптической плотности растворов определяли процент задержки роста культуры (таблица).

pic_33.tif

Рис. 4. Результаты воздействия полипропиленовой пленки, модифицированной комплексами на основе CoPc(3,5-di-tBuPhO)8, в течение 24 часов на жизнедеятельность микроорганизмов Staphylococcus aureus: 1 – контрольный образец; 2 – CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 + УФ; 3 – (Pyz)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 + УФ

Влияние химической структуры комплексов на антибактериальную/противогрибковую активность

Образцы ПП пленки, модифицированные синтезированными соединениями

Подавление роста культуры, %

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Candida albicans

Контроль

0

0

0

Контроль + УФ

5

3

0

CoPc(3,5-di-tBuPhO)8

52

0

29

CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 + УФ

68

20

37

(Py)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8

66

5

32

(Py)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 + УФ

82

17

35

(Pyz)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8

71

10

33

(Pyz)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 + УФ

93

10

38

Полученные данные свидетельствуют о том, что синтезированные супрамолекулярные комплексы не проявляют антибактериальную активность относительно кишечной палочки Escherichia coli. По балльной системе данные соединения можно оценить в 2 балла, что соответствует незначительному снижению количества микроорганизмов, указывая на недостаточное антимикробное действие [6]. Также наблюдается только незначительный противогрибковый эффект по отношению к Candida albicans. Максимальный процент подавления роста культуры проявляют CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 и (Pyz)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 при предварительном УФ облучении образцов (λ = 356 нм) в течение 2 минут. Синтезированные соединения на основе (октакис3,5-ди-трет-бутилфенокси)фталоцианинато)кобальта (II) показывают наилучшее антибактериальное действие по отношению к Staphylococcus aureus. В 3 балла (90–94 %), что соответствует значительному снижению количества микроорганизмов (хороший антимикробный эффект), можно оценить действие донорно-акцепторного комплекса (Pyz)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8, при предварительном УФ облучении (λ = 356 нм) в течение 2 минут. Без облучения наблюдается недостаточное антимикробное действие (таблица). Возможно, такое избирательное антибактериальное/противогрибковое действие на различные микроорганизмы связано со строением последних. Грамотрицательные бактерии обладают высокоорганизованной внешней мембраной по сравнению с грамположительными бактериями, что создает более высокий барьер для проникновения фотосенсибилизаторов в клетки [9].

Таким образом, установлено, что синтезированные супрамолекулярные аксиальные комплексы на основе окта(3,5-ди-трет-бутилфенокси)фталоцианинато)кобальта (II), иммобилизированные на поверхности полипропилена, обладают антибактериальным действием против золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) только при активации макрогетероциклического агента УФ светом (λ = 356 нм). В случае грамотрицательных бактерий Escherichia coli антибактериальный эффект практически не наблюдается. Относительно Candida albicans исследуемые донорно-акцепторные системы обладают слабовыраженным противогрибковым действием.

Полученные супрамолекулярные системы на основе окта(3,5-ди-трет-бутилфенокси)фталоцианинато)кобальта(II) могут быть перспективными для создания антибактериальных материалов нового поколения, которые могут использоваться не только в сфере медицины, но и в других областях, где необходимы средства профилактики и защиты от воздействия бактерий.

Заключение

1. Проведено исследование антимикробных свойств образцов пленок на фирмикутных бактериях Staphylococcus aureus, грациликутных бактериях Escherichia coli и грибах Candida albicans на плотных средах и в жидких питательных средах. По результатам испытаний установлено, что на плотных питательных средах исследуемые образцы не проявляют антимикробной активности. Зоны задержки роста тест-культур вокруг исследуемых образцов не выявлены, но под некоторыми образцами рост микроорганизмов отсутствовал.

2. Результаты испытаний образцов в жидких питательных средах с последующим высевом подтвердили данные, полученные при испытаниях на плотных питательных средах (сплошной рост тест-культур – 1000 КОЕ/мл – посевная доза) в отношении Escherichia coli и грибов Candida albicans. В отношении Staphylococcus aureus выявлено отсутствие роста у образца (Pyz)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 и минимальный рост (45 КОЕ) – у образца (Py)CoPc(3,5-di-tBuPhO)8 при предварительном УФ облучении.

Работа выполнена на оборудовании Центра коллективного пользования «Верхневолжский региональный центр физико-химических исследований» и при финансовой поддержке гранта РФФИ № 15-43-03013-р-центр-а).