В современных условиях развития научно-технического прогресса человечество подвергается тотальному воздействию неблагоприятных факторов внешней среды. К XXI столетию в биосфере накопилось около 4 миллионов токсических веществ, среди которых потенциально опасны и биодоступны около 100 тысяч ксенобиотиков [3]. По данным медицинской статистики, более 80 % болезней обусловлены загрязнением окружающей среды.
Известно, что развитие целого ряда патологических состояний организма человека сопровождается усилением образования активированных кислородных метаболитов и свободных радикалов, которые могут вызвать повреждение биологически важных молекул и в конечном итоге привести к гибели клетки [2]. Свободнорадикальное окисление и, в частности, пероксидное окисление липидов играет важную роль в патогенезе инфаркта миокарда, атеросклероза, бронхолегочных и других заболеваний [5]. Активация реакций свободнорадикального окисления наблюдается при воздействии внешних факторов (радиация, табачный дым, смог, промышленная пыль), при большинстве патологий, а также при употреблении ряда лекарственных препаратов.
Наибольшую опасность среди токсикантов представляют полихлорированные бифенилы, обладающие чрезвычайно высокой физико-химической стабильностью и устойчивостью к биологической деградации. Благодаря высокой липофильности, хлорбифенилы обладают выраженной способностью к аккумуляции в звеньях пищевой цепи и далее в органах с высоким содержанием липидов и интенсивным стероидогенезом (нервная ткань, надпочечники, яичники, яички) [7]. В результате интоксикации бифенилами выявляются изменения нервной, иммунной, эндокринной, кардиоваскулярной и репродуктивной систем, развитие гепатотоксических, канцерогенных и других эффектов [6, 8, 9]. Хлорпроизводные бифенилы в организме вызывают окислительный стресс, способствуя развитию острых и хронических заболеваний, для профилактики и лечения которых необходимы эффективные антиоксиданты, способные подавить свободнорадикальное окисление.
В связи с вышеизложенным одним из приоритетных направлений фармации является создание препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами, с целью применения их для коррекции процессов, сопровождающихся усилением свободнорадикальных реакций. За последние десятилетия в медицине и фармации резко возрос интерес к лекарственным средствам природного происхождения, имеющим ряд преимуществ перед синтетическими аналогами, к которым следует отнести отсутствие побочных эффектов и более мягкое терапевтическое действие.
Широкие перспективы для практического использования в качестве лекарственных препаратов антиоксидантного действия представляют биологически активные вещества растительного происхождения, содержащие компоненты флавоноидной природы [4]. Интересными с точки зрения антиоксидантных свойств являются специфические органические вещества почв и торфов – гумусовые кислоты [10]. На наш взгляд, перспективной группой природных соединений являются низкоминерализованные иловые сульфидные грязи, формирование которых в гидротермальных условиях при незначительном перепаде температур, длительном периоде биологической активности, отрицательном значении редокс-потенциала, обусловленного наличием SH-групп, обуславливает их антиоксидантные свойства. Информация в литературе об антиоксидантных свойствах специфических органических веществ пелоидов представлена незначительным количеством работ [1]. Преобладающим компонентом гумусловых кислот пелоидов являются гуминовые кислоты. Это группа родственных высокомолекулярных соединений с высоким содержанием фенольных гидроксилов, способных к образованию комплексов с переносом заряда.
Целью данной работы является исследование детоксикационной активности гуминовых кислот пелоидов в модели окислительного стресса, вызванного хлорбифенилами методом Fe2 + -индуцированной хемилюминесценции, который позволяет регистрировать коротко живущие радикалы супероксидного и синглетного кислорода, а также гидроксильные радикалы перекисного характера.
Объектом исследования явились гуминовые кислоты, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей Поволжского региона. Препарат представляет собой темно-бурые, почти черные игольчатые кристаллы с металлическим блеском, нерастворимые в воде, растворимые в щелочах и выпадающие в осадок при кислотности растворов меньше двух единиц показателя кислотности.
Экспериментальные исследования выполнены на белых беспородных крысах половозрелого возраста массой 180–220 г в соответствии с «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1996). Окислительный стресс животных вызывали действием раствора смеси полихлорированных бифенилов торговой марки «Совол», содержащий 26 % тетра-, 64,6 % пента- и 9 % гексахлорбифенилов в оливковом масле в дозе 600 мг/кг (0,1 LD50). Лабораторный эксперимент осуществлялся с использованием трех групп животных (по 10 особей в каждой), первая из которых являлась контрольной. У животных второй и третьей групп моделировали острое отравление путем однократного введения полихлорированных бифенилов в дозе 0,1 ЛД50, с помощью специального металлического зонда. Животные контрольной группы получали оливковое масло (1-ая группа). Животным контрольной группы и группы сравнения (2-ая группа) вводили по 0,2 мл физиологического раствора (0,9 % NaCl). Животным третьей группы однократно вводили подкожно инъекцию 0,2 мл 0,1 %-ного раствора гуминовых кислот (ГК).
Длительность эксперимента составляла десять суток, в течение которых каждые сутки для контроля параметров осуществлялся забор крови. Показатели крови исследовали с помощью хемилюминесцентного анализа, который позволяет регистрировать интенсивность процесса свободнорадикального окисления непосредственно в крови. В качестве люминоформа использовали гептагидрат сульфата железа (II), который в виде 0,05 М раствора добавляли в объеме 1 мл к 1 мл плазмы крови. Параметры свечения регистрировали с использованием отечественного хемилюминометра ХЛ-003.
Для определения детоксицирующего действия гуминовых кислот исследуемые образцы крови анализировали с помощью Fe2 + -индуцированной хемилюминесценции и определяли от момента введения ионов железа (II) показатели медленной вспышки, амплитуду медленной вспышки (максимальная светимость – H Fe2 +), светосумму (S Fe2 +), спонтанную светимость (Sp), а также латентный период (R). Обработку хемилюминограмм производили с помощью специализированной компьютерной программы по Р.Р. Фархутдинову и В.А. Лиховских. Величины показателей выражали в условных единицах. Полученные результаты анализа крови лабораторных животных в указанном режиме показали, что полихлорированные бифенилы вызывают окислительный стресс. В табл. 1 приведены показатели хемилюминесценции плазмы крови крыс трех исследуемых групп на третьи сутки эксперимента.
Таблица 1
Показатели хемилюминесценции плазмы крови лабораторных животных на третьи сутки эксперимента
|
Показатели хемилюминесценции |
h |
H Fe2 + |
S Fe2 + |
Sp |
R |
|
1 группа (контрольная) |
3,09 ± 0,50 |
2,01 ± 0,10 |
7,14 ± 0,80 |
1,93 ± 0,50 |
1,54 ± 0,10 |
|
2 группа (сравнение) |
4,00 ± 0,30 p < 0,46 |
3,99 ± 0,10 |
11,45 ± 0,10 p < 0,0013 |
3,99 ± 0,49 p < 0,0400 |
1,16 ± 0,10 p < 0,052 |
|
3 группа (лечение ГК) |
2,99 ± 0,1 p < 0,0330 |
2,82 ± 0,1 p < 0,0003 |
7,89 ± 0,1 p < 0,0001 |
1,46 ± 0,12 p < 0,0017 |
2,13 ± 0,10 p < 0,0007 |
Как видно из приведенных данных, показатели хемилюминесценции плазмы крови у здоровых крыс (1 группа) на третьи сутки эксперимента составили: светосумма – 7,14 усл. ед., спонтанная светимость– 1,93 усл. ед., интенсивность амплитуды быстрой вспышки – 3,09 и амплитуда медленной вспышки– 2,01 усл. ед.
Добавление полихлорированных бифенилов значительно активизирует процессы свободнорадикального окисления. У животных второй группы показатели хемилюминесценции достоверно изменились по сравнению с контрольной (табл. 1). Спонтанная светимость, отражающая скорость расходования свободных радикалов, окисляющих преимущественно субстраты липидной природы, увеличилась в 2,1 раза по сравнению с нормой (группа 1). Амплитуда быстрой вспышки, характеризующая содержание гидроперекисей в пробе, увеличилась в 1,3 раза, а латентный период, определяющий окисление липидов в зависимости от содержания антиоксидантов, ожидаемо понизился в 1,3 раза. Интенсивность свободнорадикального окисления по характеру медленной вспышки во второй группе животных возросла на третьи сутки приблизительно в 2 раза, а величина светосуммы (S Fe2), показывающая склонность антиоксидантной системы к развитию цепных процессов окисления, увеличилась в 1,6 раза по сравнению с контрольной. Таким образом, вводимый препарат «Совол» по данным хемилюминесценции достоверно активирует процессы свободнорадикального типа и провоцирует нарастание окислительного стресса физиологических систем лабораторных животных.
Гуминовые кислоты, введенные животным третьей группы, существенно влияют на параметры хемилюминесценции (табл. 1). Значения величин светосуммы пришли практически к норме и составили 7,89 усл. ед., что свидетельствует об увеличении толерантности животных к протеканию свободнорадикальных реакций. Величина спонтанной светимости уменьшилась в 2 раза по сравнению с группой сравнения, составив 1,46 усл. ед., что ниже аналогичного значения показателей контрольной группы животных на 25 %. Очевидно, что гуминовые кислоты за счет взаимодействия с оксидантами обеспечивают необходимый уровень защиты веществ липоидного характера. Симбатно уменьшились показатели быстрой и медленной вспышки в 1,3 и 1,4 раза соответственно по отношению ко второй группе животных; при этом показатель быстрой вспышки отвечал значению нормы. Латентный период составил 2,13 усл. ед, что превышает не только данный показатель группы сравнения, но и на 28 % увеличивает время начала свечения в контрольной группе (табл. 1). Данный факт достоверно доказывает детоксицирующее действие гуминовых кислот пелоидов.
Таблица 2
Показатели хемилюминесценции плазмы крови лабораторных животных на десятые сутки эксперимента
|
Показатели хемилюминесценции |
h |
H Fe2+ |
S Fe2+ |
Sp |
R |
|
1 группа (контрольная) |
3,10 ± 0,50 |
2,05 ± 0,10 |
7,20 ± 0,80 |
1,88 ± 0,50 |
1,62 ± 0,10 |
|
2 группа (сравнение) |
6,03 ± 0,40 p < 0,46 |
2,52 ± 0,03 p < 0,0001 |
9,01 ± 0,16 p < 0,0013 |
2,70 ± 0,20 p < 0,0400 |
1,44 ± 0,10 p < 0,052 |
|
3 группа (лечение ГК) |
3,07 ± 0,1 p < 0,0007 |
2,05 ± 0,1 p < 0,00246 |
5,91 ± 0,1 p < 0,0001 |
1,39 ± 0,12 p < 0,00119 |
1,98 ± 0,2 p < 0,00841 |
В табл. 2 приведены показатели хемилюминесценции плазмы животных на десятые сутки эксперимента. Как видно из полученных результатов, в группе сравнения амплитуда быстрой вспышки, максимальная светимость, светосумма и спонтанная светимость больше в 1,95; 1,23; 1,25 и 1,44 раза соответственно по отношению к контрольной группе животных.
Сравнение параметров хемилюминесценции плазмы животных второй группы на третьи и десятые сутки показывает некоторое уменьшение значений максимальной и спонтанной светимости, а также светосуммы. Очевидно, что на 10 сутки антиоксидантные системы крови в организме животных группы сравнения несколько понижают процессы свободнорадикального окисления. Однако существенное увеличение (в 1,5 раза) значения быстрой вспышки свидетельствует о значительной активности окислительных реакций.
В третье группе экспериментальных животных окислительно-восстановительный статуса плазмы под действием гуминовых кислот пелоидов восстанавливается, наблюдается понижение показателей хемилюминесценции (табл. 2).
Значения величин быстрой вспышки и латентного периода составляют 3,07 и 1,98 усл. ед. соответственно, что близко к показателям физиологической нормы. Следует отметить, что полученные данные светосуммы и спонтанной светимости имеют значения ниже аналогичных величин плазмы животных контрольной группы. Это связано, по-видимому, с тем, что гуминовые кислоты включаются в редокс-буферные системы крови и достоверно понижают процессы свободнорадикального окисления, услиливая иммунологический статуса организма животных.
Таким образом, экспериментально установлено детоксицирующее действие гуминовых кислот пелоидов, которые нивелируют свободнорадикальные процессы, повышая резистентность систем крови в модели окислительного стресса.
Следует отметить, что действие гуминовых кислот пелоидов как антиоксидантов имеет универсальный характер и комплексно влияет на окислительные реакции различного типа. Гуминовые кислоты низкоминерализованных иловых сульфидных пелоидов представляют значительный интерес с позиций создания антиоксидантных лекарственных препаратов природного происхождения.
На основании экспериментальных данных можно сделать следующие выводы:
1. Воздействие полихлорированных бифенилов вызывает окислительный стресс, который достигает своего максимума на третьи сутки.
2. Гуминовые кислоты пелоидов обладают выраженным детоксицирующим действием, достоверно понижая окислительный стресс и приводя окислительно-восстановительный статус организма лабораторных животных в физиологическую норму.