Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

Исследование микробных сообществ термокарстовых ландшафтов Северо-Восточной Сибири является малоизученной проблемой микробной экологии. Образование уникальных ландшафтов связано с изменением климата и является результатом таяния вечной мерзлоты [4]. Природные сообщества, образующиеся на дне термокарстовых провалов, отличаются от сообществ, окружающих ландшафтов как своим видовым составом, так и разнообразием представленных в них видов. Кроме того, в процессе достаточно стремительного переотложения толщ вечной мерзлоты, на поверхность грунтов выходит ранее заключенная в ней органика, сохранившаяся в результате криоконсервации в условиях низкой микробиологической активности. Это приводит к загрязнению органическими веществами водоемов, насыщению органикой формирующихся экосистем и включению ее в круговорот веществ [4, 6].

Батагайский провал – термокарстовое образование, расположенное в Верхоянском районе Якутии (Республика Саха) в окрестностях поселка Батагай, вдоль безымянного притока ручья Батагайка, впадающего в р. Яна. Образование термокарста берет начало с 1969 г., когда на его месте наблюдалась провальная форма рельефа, но более активное развитие процессы термоденудации получили с рубежа 1980–1990-х гг. [4]. Высота провала составляет 40 метров, а протяженность более 2 км. В результате интенсивной оттайки вечной мерзлоты в июле-августе происходят обвалы из верхних слоев грунта вместе с растительностью, растущей на поверхности вдоль кромки термокастра и палеопочв с включениями ископаемой фауны из вскрытых термокастом толщ [5]. Рост отдельных участков провала достигает 7–15 м в год. В отличие от термокарстовых озер, способствующих выполаживанию дна и более равномерному распределению в пределах термокарстовых образований вещества, вносимого в результате термоденудации, Батагайский провал дренируется, что приводит к образованию на его дне пересеченного рельефа и постепенно формируются экосистемы внутри провала. Сукцессионные изменения растительного покрова дна провала наблюдаются от термоэрозионной промоины в центре провала к его кромке. Микробиологические сообщества провала, их динамика и распределение изучены слабо и представляют интерес в качестве микроиндикаторов процессов современного ландшафтообразования [3].

До появления метагеномных методов анализа изучение почвенных микробных сообществ было основано на выделении культур микроорганизмов и изучении их биологических свойств. Однако в результате исследований почвенного микробиома молекулярно-генетическими методами было обнаружено, что доля культивируемых бактерий может составлять менее 1 % [24] состава микробных сообществ. С помощью метагеномных методов анализа были исследованы большие территории земной поверхности [10, 15, 16]. Однако в ряде случаев интерпретация результатов метагеномного анализа вызывает немало вопросов у исследователей [18, 23].

С появлением метагеномных методов исследования большинство ученых восприняло столь большое биоразнообразие микроорганизмов в достаточно бедных и экстремальных средах как существование «редкой биосферы» [21]. Ранее считалось, что объединение ридов в ОТЕ (оперативная таксономическая единица) является объединением ошибок ПЦР-амплификации и приводит к необъективным результатам секвенирования [20] и значительному завышению биоразнообразия микробных сообществ [9]. ПЦР-амплификация является и сегодня одним из слабых мест метагеномного анализа.

На этапе биоинформационного анализа фильтрация ошибок секвенирования имеет важное значение для интерпретации результатов, так как они могут быть связаны с контаминацией проб при подготовке к ПЦР-амплификации, подготовке библиотек или неточностями секвенирования. Зачастую это приводит к формированию большого количества химерных последовательностей, которые могут повлиять на распределение таксонов при секвенировании [8] или повышение количества неидентифицируемых ридов, особенно при анализе микробных сообществ малоизвестных территорий. Построение анализа, на основе гомологии с известными последовательностями нуклеотидов, из баз данных, существенно сдвигает результат исследования в сторону более известных таксонов. Это не только увеличивает количество неидентифицируемых ридов, но и затрудняет сопоставимость образцов.

В последнее время активно развивается новое направление молекулярно-генетических исследований – сравнительная метагеномика [15], изучающая экологическую обусловленность существования и взаимодействия сообществ микроорганизмов, расположенных на отдельных участках ландшафта. Делаются попытки с помощью методов сравнительной метагеномики разобраться в особенностях функционирования микробных сообществ, находящихся в разных экологических условиях [14]. Появляются новые, мощные инструменты для сравнительного метагеномного анализа микробных сообществ [17], на основе которого возможно построение моделей межмикробных взаимодействий в микробиоценозах.

Однако изучение влияния экологических факторов на микробное сообщество, зачастую ограничивается несколькими учитываемыми факторами, что приводит к отличиям результатов метагеномного анализа, полученных разными исследователями при анализе одних и тех же образцов грунта и воды.

Поэтому, несомненно, что для получения воспроизводимых результатов необходимо учитывать все (или большинство) экологические факторы, влияющие на качественный состав микробных сообществ. Кроме того, точки отбора проб планируются эмпирически и в большей степени носят характер зондирования территории [1, 2]. При этом они никак не связаны между собой и могут находиться на участках с различными физико-химическими условиями (химический состав почвы, pH грунта, микроклимат). Поэтому в каждом отдельном случае нельзя не учитывать особенности образования микробных сообществ ландшафтов (неравномерность распределения рН, влажность почвы, распределение растительного покрова), приводящих к формированию «биогеографических узоров» [14] и биотических ядер экосистемы, являющихся источниками распространения микробных сообществ и ограничивающихся влиянием биотических и абиотических факторов окружающей среды. Зачастую результаты метагеномных исследований малоизученных территорий содержат значительное количество неидентифицируемых ридов, отсутствующих в базах данных.

Кроме того, наиболее популярными показателями, которые часто используются для сравнительного анализа микробных сообществ, полученных с помощью метагеномного секвенирования, являются индекс Шеннона, Чао и Симпсона [11]. Статистическая оценка биоразнообразия микробных сообществ, основанная на результате метагеномного анализа, адекватно отражает реальное соотношение микроорганизмов в сообществе лишь при учете всех таксонов, входящих в микробное сообщество. Учитывая большое количество неидентифицируемых ридов и значительное число некультивируемых в лабораторных условиях микроорганизмов, содержащихся в пробах воды и грунта, отобранных эмпирически, без учета топографического распределения микробных сообществ ландшафтов, результаты метагеномного анализа не могут в полной мере отражать реальную картину биоразнообразия микробных сообществ уникальных ландшафтов.

В связи с этим целью нашего исследования явилась разработка методических приемов отбора проб воды и грунта при исследовании уникальных ландшафтов Батагайского провала.

Материалы и методы исследования

В этой работе был проведен сравнительный метагеномный анализ воды отобранной из ручья и лужи Батагайского провала. Пробы воды отбирали из двух точек, находящихся на расстоянии 9 метров друг от друга, из ручья с частицами грунта, протекающего по дну Батагайского провала и лужи с элементами оттаивающей органики.

Пробы были отобраны в летне-осенний период 2014 года. После отбора пробы помещались в термоконтейнер и хранились там при температуре – 5 °С. Для GPS-позиционирования использовали модель GPS-навигатора Garmin Oregon 650 (GPS + Glonass). Дальнейшие исследования проводили в ЦКП «Персистенция микроорганизмов» ИКВС УрО РАН. Пробы воды из ручья и лужи Батагайского провала, в объеме 300 мл, фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», США). Фильтры оставляли в рефрижераторе (– 20 °С) до проведения 16S метагеномного анализа.

ДНК из проб воды выделяли методом химической экстракции [19], в модификации Бельковой и соавт. [7]. Каждый образец инкубировали в 300 мкл стерильного буфера для лизиса (20 ммоль/л ЭДТА, 14000 ммоль/л NaCl, 100 ммоль/л ТРИС HCl, pH 7.5) с добавлением 50 мкл лизоцима (100 мг/мл) и додецилсульфата натрия до 1 %. Смесь инкубировали в течение 30 минут при 60 °С. Экстрагировали смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1) и смесью хлороформ-изоамиловый спирт (24:1). ДНК в водной фазе осаждали ацетатом аммония (10 моль/л) и трехкратным объемом безводного этанола в течение ночи при 20 °С. После центрифугирования и двукратной промывки 80 %-ным этанолом ДНК высушивали и растворяли в ТЕ-буфере. Чистоту ДНК проверяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле. Концентрацию ДНК оценивали на флуорометре Qubit 2.0 (Life Technologies).

Подготовку библиотек ДНК и 16S секвенирование проводили в ЦКП «Персистенция микроорганизмов» ИКВС УрО РАН (Оренбург). 16S библиотеки ДНК получали в соответствии с руководством Illumina (http://support.illumina.com/documents/ documentation/chemistry documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf), с использованием праймеров, ограничивающих V3 и V4 области гена SSU рибосомальной РНК (ррнк). Высокопроизводительное секвенирование (NGS) проводили на секвенаторе MiSeq (Illumina, USA) в центре коллективного пользования научным оборудованием «Персистенция микроорганизмов». Биоинформатическую обработку и анализ данных проводили с помощью программы USEARCH v8.0.1623 _win32. [12]. В результате дерепликации и кластеризации последовательностей нуклеотидов их объединяли в ОТЕ (оперативные таксономические единицы) с уровнем филогенетического сходства 97 %. Для обнаружения и удаления химер использовали программу UCHIME [12].

Результаты исследования и их обсуждение

В результате метагеномного анализа пробы воды из ручья (Проба № 1), протекающего на дне Батагайского провала, было получено 139565 ридов. В зависимости от их принадлежности к определенной таксономической группе риды распределились следующим образом: на филогенетическом уровне – 131580 (94,3 %) ридов, на уровне классов – 127790 (91,6 %), порядков – 122688 (87,9 %), семейств – 110885 (79,5 %), родов – 104836 (75,1 %) и видов – 41650 (29,8 %). В основном большинство ридов 139305 (99,8 %) относилось к прокариотам, лишь 8 (0,01 %) к археям и 252 (0,18 %) к неизвестным таксонам.

На филогенетическом уровне все риды были собраны в 25 уникальных ОТЕ, 7 из которых представлены в таблице. Наибольший процент всех идентифицированных таксонов составляли филы Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и Planctomycetes. Это соответствует основным широко распространенным таксонам встречающихся в почвах северных территорий. На уровне семейства все риды были собраны в 211 ОТЕ, среди семи уникальных ОТЕ доминировали – Rhodocyclaceae, Rhodospirillaceae, Hyphomicrobiaceae и Legionellaceae. На видовом уровне идентифицировано 711 таксонов, 7 из них представлены в таблице. При этом на всех таксономических уровнях отмечался значительный рост относительного количества неидентифицируемых ридов. Так на филогенетическом уровне доля неидентифицированных ридов составляла 10,7 %, семейств – 25,3 %, а на видовом уровне количество неидентифицируемых ридов значительно выросло и составило более 70 %. В дальнейшем, с помощью биоинформационного анализа, были удалены 489 химерных последовательностей и ридов содержащих менее 415 bp. В результате было собраны 16 уникальных ОТЕ, из них лишь 6 ОТЕ принадлежали к культивируемым бактериям и 10 ОТЕ к некультивируемым прокариотам (с достоверностью – 97 %).

Пробу воды (Проба № 2) из лужи, с оттаивающей органикой, отбирали на расстоянии 9 метров от первой точки. При сравнении с первой пробой, общее количество идентифицированных прочтений было значительно ниже (128611 ридов). Однако различия в общем количестве прочтений не коснулись их таксономических соотношений. Все идентифицированные риды были распределены в соответствии с их таксономическими группами: филы – 121394 (94,4 %), классы – 119698 (93,1 %), порядки – 115451 (89,8 %), семейства – 101678 (79,1 %), роды – 97848 (76,1 %) и виды – 52821 (41,1 %). Большинство идентифицируемых прочтений нуклеотидов относилось к прокариотам 128477 (99,9 %), лишь 2 рида к археям и 132 (0,1 %) к неклассифицируемым таксонам.

На филогенетическом уровне доминировали Proteobacteria, Chlamydiae, Firmicutes и Planctomycetes (таблица) и минорные филы (Tenericutes, Actinobacteria), а доля неклассифицируемых таксонов составила 10,5 %. На уровне семейства мажорные таксоны были представлены – Rhabdochlamydiaceae, Hyphomicrobiaceae и Comamonadaceae, а количество не классифицируемых прочтений возросло до 25,6 %, в сравнении с Пробой № 1. На уровне вида количество идентифицированных таксонов составляло всего лишь 12,5 %. Среди них с наибольшей частотой встречались Candidatus Rhabdochlamydia crassificans, Phyllobacterium catacumbae и Desulfonatronum thiosulfatophilum, а неклассифицируемые риды составляли более 60 %. С помощью биоинформационного анализа из 128611 ридов было собрано 918 ОТЕ и 667 химерных последовательностей (2,8 %), из оставшихся удалены ОТЕ, содержащие менее 40 нуклеотидов. Риды, содержащие более 400 последовательностей нуклеотидов, объединены в 16 ОТЕ. Из них лишь 5 ОТЕ были идентифицированы как культивируемые бактерии, а 11 ОТЕ как некультивируемые (с достоверностью 97 %).

На основании анализа полученных данных, содержащих большое количество неидентифицируемых ридов и различий в филогенетическом составе микробных сообществ, полученных из близлежащих точек, нами был предложен способ отбора проб (воды и грунта) для проведения метагеномного анализа микробных сообществ уникальных ландшафтов.

На первом этапе исследования формируется карта-схема географического объекта (Батагайский провал), в зависимости от площади с сеткой (ячейка – 9 м2) и равноудаленными точками (узлы сетки). Пробы грунта отбирают из равноудаленных точек (9, 18, 27 метров), в пределах окружности с центром в точке GPS-позиционирования и диаметром 1 метр (радиус 50 см), разделенной на 8 секторов с углом 45 °. Отбор проб грунта производится стеклянными стерильными цилиндрами 2/10 см, на глубину 5 см. После отбора грунта лунка выемки грунта засыпается грунтом с краев лунки отбора. Контаминация проб бактериями с обуви исследователя в дальнейшем вносится в качестве негативного контроля. Систематизация данных метагеномного анализа с GPS-позиционированием позволит не только охарактеризовать микробные сообщества, находящиеся в равноудаленных точках, но и определить границы сообществ и осуществлять их хронологический мониторинг. Появление новых грунтов с увеличением площади провала за счет разрушения стен лёсса не нарушит систему GPS-позиционирования точек отбора проб и позволит отбирать пробы в той же точке, но уже изменившегося ландшафта.

Сравнительный филогенетический анализ двух проб воды, из ручья и лужи Батагайского провала, показал, что основными таксонами, образующими микробные сообщества Батагайского провала, являются представители фил Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Planctomycetes и Chlamydiae. Отличия филогенетического состава сообществ микроорганизмов были связаны с менее представленными филами (Verrucomicrobia, Nitrospirae, Tenericutes, Actinobacteria). Это свидетельствует об особенностях формирования качественного состава микробных сообществ на разных участках Батагайского провала.

Как неоднократно было показано, с помощью методов метагеномного анализа, биоразнообразие микробных сообществ почв представлено ограниченным числом мажорных таксонов, имеющих повсеместное распространение, однако отличия характерны для качественного состава минорных таксонов и их топографического распределения. В этой связи несомненный интерес представляет изменение состава менее представленных таксонов при изменяющихся климатических условиях.

В последнее время активно развиваются методы биосенсорики территорий [22], т.е. использование природных бактериальных сообществ в качестве экологических датчиков (индикаторов), изменяющихся при загрязнении окружающей среды. Использование предложенного нами способа филогенетического картирования уникальных ландшафтов будет способствовать выявлению биосенсоров качественных изменений микробных сообществ, происходящих под действием биотических и абиотических факторов внешней среды.

Способ отбора проб грунта из равноудаленных точек будет способствовать анализу топографического распределения микробных сообществ уникальных ландшафтов Батагайского провала, а в сочетании с физико-химическим анализом позволит оценить влияние химического состава почв и воды на качественный состав микробных сообществ. Точная локация при отборе проб позволит выявить биологические ядра экосистемы уникальных ландшафтов и проводить мониторинг их изменений. В перспективе исследований, на основании полученных данных, можно будет составить геоинформационную систему «Микробные сообщества Батагайского провала», отражающую качественный состав микробных сообществ Батагайского провала, а снижение стоимости секвенирования приведет к доступности этого метода анализа [13].

Работа проведена в рамках проекта «Ландшафтно-экологическое обоснование организации национального природного парка на Новосибирских островах» программы фундаментальных исследований РАН 44П «Поисковые фундаментальные научные исследования в интересах развития Арктической зоны Российской Федерации».

Работа была выполнена на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием «Персистенция микроорганизмов» ИКВС УрО РАН.