Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

Фотодинамическая терапия (ФДТ) и связанная с ней флуоресцентная диагностика (ФД) представляют собой принципиально новую стратегию обнаружения и лечения ряда заболеваний, основанную на накоплении в патологических клетках особых веществ – фотосенсибилизаторов (ФС), что позволяет визуализировать их в режиме реального времени и эффективно разрушать путем запуска каскада фотохимических реакций с помощью видимого света [11–13, 15]. К настоящему времени в клинической практике используется множество ФС для диагностики и лечения онкологических заболеваний, бактериальных инфекций, псориаза и т.д. [11, 12]. Большинство препаратов представляют собой малотоксичные водорастворимые субстанции, обычно вводимые в организм внутривенно капельно в дозе 0,5–2,5 мг/кг веса либо аппликационно непосредственно в очаг воспаления. Основной побочный эффект при проведении ФДТ – достаточно длительный период остаточной фототоксичности [12, 14]. Вследствие этого пациентам рекомендуется после проведения сеанса избегать воздействия прямых солнечных лучей на открытые участки кожи от нескольких дней до двух и более месяцев в зависимости от использованного ФС [11, 12].

Что касается каких-либо системных эффектов, связанных с токсическим воздействием ФС на организм в целом, многочисленные исследования указывают на крайне малую токсичность используемых препаратов [11, 13, 15]. В частности, один из наиболее часто используемых ФС хлоринового ряда «Фотолон» имеет величину летальной дозы LD50 порядка 200 мг/кг веса, что почти в 100 раз выше максимально используемых доз при проведении ФДТ. Тем не менее информация о взаимодействии как самих ФС, так и используемых при приготовлении их лекарственных форм различных добавок с биообъектами важна для оценки токсичности и взаимодействия с биомембранами [1].

Ранее [2, 5, 14] нами был получен и протестирован ряд растворимых в воде или водных растворах ПАВ ФС хлоринового типа (соединения I–IV), обладающих значительной фототоксичностью в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов при культивировании последних в жидких средах с содержанием фотосенсибилизатора 5*10-5–1*10-3 моль/кг и облучении видимым светом с плотностью энергии 40 Дж/см2 и длиной волны 660 нм.

Полученные результаты позволили предложить исследованные соединения в качестве потенциальных ФС для борьбы с различными, в том числе резистентными к антибиотикам, штаммами микроорганизмов.

В моделях культуры тканей или при моделировании in vivo разнообразие экспрессируемых участков генома клеточных диферонов, а как следствие, и тканеспецифичные особенности метаболизма, обуславливают широкий спектр цитотоксических проявлений воздействия экзогенных химических агентов. В связи с этим мембрана эритроцитов рассматривается в качестве удобной интегральной модели строения, свойств и типовых реакций плазматических мембран клеток различных тканей и органов человека. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов является чутким маркером различных неблагоприятных воздействий на организм [6, 7, 9].

Цель исследования

Оценить вероятное защитное действие и темновую токсичность ряда заряженных и незаряженных производных хлорофилла α на клетки крови in vitro.

Материалы и методы исследования

В работе использовался современный подход к оценке биологических эффектов новых химических соединений путем тестирования веществ на клетках крови in vitro.

В качестве объектов исследования выступали четыре потенциальных фотосенсибилизатора:13(1)-N-метиламид,17(3)-[2,3-дигидроксиметил-1,4-хиноксалиниловый эфир] хлорина e6 (I), 3(1),3(2)-бис-(N’N’’N’’’-триметиламинометил)-13(1)-(N’N’N’’’-триметиламиноэтил)амид хлорина е6 трийодид (II), 13(1)-(N’N’’N’’’-триметиламиноэтил) амид хлорина е6 йодид (III) и 3(1),3(2)-бис-(N’N’’N’’’-триметиламинометил)-13(1)-N-метиламид хлорина е6 дийодид (IV). Соединения были синтезированы, очищены и спектрально идентифицированы в соответствии с методиками, представленными в работах [11, 15].

Растворы макрогетероциклов I–IV в 0,9 % водном растворе NaCl, содержащем от 1 до 3 массовых процентов ТВИН 80 (Panreac, EU), готовили следующим образом: растворяли навески ФС и сольюбилизатора в легколетучем органическом растворителе, затем с целью повышения растворимости ФС в воде через включение его в мицеллу ПАВ, соосаждали компоненты раствора путем полного выпаривания растворителя; полученную матрицу растворяли в изотоническом растворе NaCl.

Цельную кровь белых крыс инкубировали с исследуемыми веществами в исходной концентрации (до разбавления) 10-4, 5·10-4, 10-3 и 5·10-3 моль/кг в течение 0,5, 1, 2, 3 и 4 часов, причем в каждом случае к 1 мл крови прибавляли 0,5 мл раствора фотосенсибилизатора, после чего определяли поверхностную цитоархитектонику эритроцитов.

Для исследования цитоархитектоники клеток кровь фиксировали в 1 %-ном растворе глютарового альдегида («Fluka», Switzerland). Затем, после 24-часовой фиксации при температуре + 4 °С готовился препарат «раздавленная капля». Подсчет клеток производился в процентах на 200 эритроцитов с использованием фазово-контрастного устройства светового микроскопа под иммерсией. Использовалась классификация, предложенная Г.И. Козинцом с соавторами [4]. Согласно этой классификации эритроциты подразделяли на десять классов:

1) дискоцит;

2) дискоцит с одним выростом;

3) дискоцит с гребнем;

4) дискоцит с множественными выростами (эхиноцит);

5) сфероцит с шипиками на поверхности;

6) куполообразный эритроцит (стоматоцит);

7) сфероцит с гладкой поверхностью;

8) эритроцит в виде «спущенного мяча»;

9) дегенеративные формы эритроцитов;

10) «тени» эритроцитов.

Первые четыре класса эритроцитов (с признаками эхиноцитарной трансформации) принято считать обратимо деформированными, так как эти клетки способны спонтанно восстанавливать форму. Остальные классы эритроцитов относятся к группе необратимо деформированных или предгемолитических форм.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе проведенного исследования in vitro выявлено, что при инкубации крови с растворителем в отсутствии фотосенсибилизатора в первые полчаса все клетки приобретали форму сфероэхиноцитов; далее, в течение 3 часов инкубации, форма клеток постепенно восстанавливалась, но через 4 часа наблюдалась стоматоцитарная трансформация с появлением сфероцитов и «теней» эритроцитов (см. табл. 1).

По всей видимости, четырех часовая инкубация приводила к старению клеток, уменьшению образования АТФ в ходе метаболизма глюкозы. Результатом этого процесса явилось ухудшение транспорта катионов, уменьшение восстановительного потенциала в клетке, снижение защиты эритроцита от окисления, мембрана теряла сиаловые кислоты, что вызывало потерю эластичности и изменение формы клетки вплоть до сферуляции [8].

В ходе исследования установлено, что образец соединения I в концентрации 10-4 моль/кг в первые три часа инкубации оказывал защитное цитопротективное действие, что подтверждается увеличением содержания в крови дискоцитов за счет снижения клеток эхиноцитарного ряда (см. табл. 2). Однако к 4 часу инкубации этот эффект исчезает, снижается количество дискоцитов и увеличивается процент необратимодеформированных форм. Вероятно, это связано с повреждающим действием «старения» на эритроциты. В больших концентрациях (5·10-4 и 10-3 моль/кг) ФС I оказывал защитное действие на эритроциты в течение первого часа инкубации, снижая эхиноцитарную трансформацию, вызываемую растворителем. Начиная со 2 часа инкубации наблюдался рост стоматоцитов, а к окончанию наблюдения в крови появлялись сфероциты и «тени» эритроцитов, что говорит о появлении гемолитической направленности изменения цитоархитектоники эритроцитов. Самая высокая концентрация (5·10-3 моль/кг) приводила к резкому снижению числа дискоцитов в крови через полчаса инкубации в основном за счет необратимой трансформации, в дальнейшем число эхиноцитов снижалось, а процент стоматоцитов и особенно сфероцитов повышался. К 4 часу инкубации практически все клетки были необратимодеформированными. Таким образом, образец ФС I в самой низкой концентрации обладает защитным цитопротекторным эффектом в отношении эритроцитов. Более высокие концентрации вызывают отсроченную стоматоцитарную трансформацию клеток, которая в максимальной концентрации вещества приводит к практически полной необратимой трансформации клеток.

Соединение II уже в низких концентрациях (10-4 и 5·10-4 моль/кг) вызывало существенные изменения поверхностной цитоархитектоники эритроцитов (см. табл. 3). Через 0,5 часа инкубации процент дискоцитов в крови падал практически до нуля за счет эхиноцитарной трансформации. Далее (через 1–2 часа) число дискоцитов повышалось, эхиноцитарная трансформация сменялась стоматоцитарной за счет противоположных эффектов фотосенсибилизатора и растворителя.

Спустя 3–4 часа в инкубируемой крови преобладали стоматоциты, сфероциты и появлялись гемолизированные эритроциты. Более высокие концентрации образца II (10-3 и 5·10-3 моль/кг) не вызывали снижение числа эритроцитов и изменение поверхностной цитоархитектоники в течение 1–2 часов инкубации, вероятно, в результате антагонистического действия стоматоцитарной направленности ФС II и эхиноцитарным эффектом действия растворителя, а затем концентрация дискоцитов резко падала. К четвертому часу эксперимента в крови практически не было нормальных клеток, присутствовали в основном предгемолитические формы, а в образце с наибольшей концентрацией – «тени» эритроцитов. Таким образом, фотосенсибилизатор II не оказывал защитного действия относительно эффекта растворителя, его повреждающее действие на эритроциты связано с выраженной стоматоцитарной трансформацией, которая при низких концентрациях ФС II противодействовала эхиноцитарному эффекту растворителя и временно замедляла трансформацию клеток. Более высокие концентрации этого вещества вызывали сильный цитотоксический эффект гемолитической направленности.

При исследовании in vitro цитотоксического влияния фотосенсибилизатора III обнаружено, что в минимальной концентрации его действие аналогично образцу II (см. табл. 3, 4). Однако при более высоком содержании это вещество вызывает снижение числа дискоцитов вплоть до их полного отсутствия в образцах. При этом трансформация клеток крови в пробе с концентрацией вещества 5·10-4 моль/кг в течение 3 часов инкубации шла по эхиноцитарному пути и лишь на четвертый час наблюдалось увеличение стоматоцитов и сфероцитов (эффект старения). В образцах с концентрацией вещества 10-3 и 5·10-3 моль/кг стоматоцитарная трансформация появлялась позже (с двух часов инкубации) и менее выраженная, чем в образце II. При этом предгемолитические клетки (сфероциты) появлялись уже через полчаса, однако степень гемолизированных эритроцитов («тени») к окончанию наблюдения была значительно ниже, чем в пробе с образцом II. Таким образом, ФС III не обладает защитным цитопротективным действием, его токсическое влияние связано с эхиноцитарной трансформацией, усугубляющей действие растворителя, которое приводит к ранним гемолитическим изменениям, однако они развиваются медленнее, чем в образце с ФС II.

Инкубация крови с образцом IV в наименьшей концентрации вызывала в первый час изменение формы эритроцитов, сходные с таковыми у образцов II и III; в дальнейшем, как и в случае c соединением III, трансформация в основном сопровождалась появлением стоматоцитов и сфероцитов (см. табл. 3–5). Следующие концентрации (5·10-4 и 10-3 моль/кг) приводили к аналогичным изменениям цитоархитектоники эритроцитов с небольшим перераспределением форм клеток в сторону сфероэхиноцитарной трансформации и увеличением сфероцитоза, при этом клеток стоматоцитарного ряда наблюдалось незначительное количество. Максимальная концентрация исследуемого вещества (5·10-3 моль/кг) вызывала наибольший цитотоксический эффект: уже через 1 час инкубации почти половина клеток гемолизировалась, а спустя 2 часа все эритроциты разрушились. Таким образом, ФС IV так же, как и образец соединения III, не оказывал цитопротекторного действия на клетки крови и вызывал эхиноцитарную трансформацию клеток с последующей сферуляцией. Однако в рабочих концентрациях 5·10-4 и 10-3 моль/кг цитотоксический эффект был несколько меньше, чем при инкубации с ФС III, а в максимальной концентрации, напротив, его гемолитическая активность была наибольшей.

Таблица 5

Концентрационно-временная динамика показателей поверхностной цитоархитектоники эритроцитов при инкубации крови в присутствии соединения IV

Характер липофильных свойств рассматриваемых соединений, безусловно, является одной из ведущих причин особенностей их трансформирующих воздействий на клеточную оболочку. Как прямое повреждение, так и перераспределение фосфолипидов мембраны по принципу «флип-флопа» определяет не только выбор пути, но и скорость деструкции элементов цитомембраны, что наблюдалось в нашем эксперименте. Кроме того, исследуемые соединения (кроме первого) имеют положительные заряды, способные взаимодействовать с отрицательно заряженными фрагментами белков и сиаловых кислот мембран. Рассматриваемые агенты, соединяясь с мембранными структурами, могут вызывать перегруппировку или агрегацию мембранных белков, изменяя фосфорилирование протеидов и ионное равновесие (накопление Са2+ в цитоплазме благодаря угнетению Са2+АТФ-азы) Ионы Са2+ вызывают снижение стабильности мембран эритроцитов, меняя характер межмолекулярных взаимодействий белков цитоскелета, что сопровождается разрушеним асимметрии фосфатидилсерина в мембранах эритроцитов. Повышение входа Са2+ в эритроциты, как известно, сопровождается Гардош-эффектом, т.е. компенсированным выходом К+ и сморщиванием клеток [10].

Результаты исследования темновой токсичности синтезированных хлоринов е6 I–IV позволяют сделать следующие заключения:

1. Соединение II обладает самым высоким цитотоксическим эффектом в рабочих концентрациях, по механизму действия вызывает стоматоцитарную трансформацию эритроцитов, противоположную эффектам растворителя без ФС. Спустя два часа происходит суммация токсических эффектов, что выражается в глубоком массивном разрушении клеток к концу последнего часа инкубации. Рост цитотоксической активности данного соединения при повышении его концентрации происходит менее интенсивно, чем у соединения IV.

2. Соединение IV в максимальной концентрации обладает самым выраженным мембраноповреждающим действием, однако в рабочих концентрациях (5·10-4 и 10-3 моль/кг) приводит к росту обратимых форм трансформации мембран эритроцитов, что закономерно сопровождается торможением процесса разрушения клеток.

3. Соединение III проявляет цитотоксический эффект очень рано, начиная с 30 минут эксперимента, однако в последующем разрушение клеток значительно тормозится.

4. Изменения, вызванные присутствием соединениея I, характеризуются двухфазностью: после 2-часовой инкубации цитотоксические эффекты были аналогичны действию соединения III, но менее выражены; до 2 часов инкубации это соединение проявляло, по-видимому, цитопротекторный эффект по отношению к перестройкам, вызванным действием сольюбилизирующей добавки ТВИН 80, содержащейся в растворителе. Вышеописанные изменения были характерны для низких концентраций соединения I.

5. По цитотоксическому эффекту исследованные фотосенсибилизаторы можно расположить следующим образом: максимальным цитотоксическим эффектом обладают соединения II и IV. Минимальный токсический эффект имеют ФС I и III, кроме того, первое соединение обладает кратковременным цитопротекторным действием. Последовательный рост темновой токсичности макрогетероциклов в отношении клеток крови в ряду соединений I < III < IV < II, то есть при переходе от незаряженного ФС к соединениям, несущим соответственно одну, две и три полярных катионных группы. Можно предположить, что все рассматриваемые фотосенсибилизаторы в ходе эксперимента проникают через клеточные мембраны эритроцитов с различной скоростью, при этом более полярные молекулы, накапливаясь в цитозоле клетки, проявляют более высокую цитотоксичность.

Токсикологической эффект фотосенсибилизаторов на клетки крови in vitro носит локальный характер, поэтому в дальнейшем требуется оценка их цитотоксичности в остром эксперименте на животных. Рекомендуется применение ФС в тех концентрациях, при которых они оказывают защитное цитопротекторное действие в отношении клеток или обладают наименьшей мембраноповреждающей активностью.