Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

В лесах Красноярского края сосредоточены продуктивные насаждения хвойных, в том числе и хозяйственноценной породы – сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.). В процессе индивидуального развития древесные виды постоянно подвергаются воздействию абиотических и биотических факторов окружающей среды. Одним из важнейших факторов, определяющих состояние лесов, являются бактериальные и грибковые заболевания, которые могут быть причиной гибели лесных насаждений. Однако основная проблема связана не столько с поражением многолетних растений, сколько с отпадом сеянцев, в частности хвойных пород, при их выращивании в лесопитомниках, что делает экономически неоправданным получение посадочного материала [5].

Фитопатогенные бактерии и грибы вызывают некрозы и хлорозы хвои, бактериальный ожог хвои и стволиков, сосудистый бактериоз, почернение и усыхание верхушечных почек и оснований хвои и стволиков, образование опухоли у прикорневой шейки, увядание и полегание всходов при поражении корневой системы.

Основным способом защиты семенного и посадочного материала хвойных пород от болезней в лесных питомниках является обработка фунгицидными и бактерицидными препаратами. Одним из отрицательных аспектов этого способа является приспособляемость возбудителей болезней к таким препаратам при многолетнем их применении; кроме этого, в результате мутаций появляются новые, не чувствительные к действующим веществам, но столь же активные виды патогенов. В связи с этим крайне актуальной является задача расширения спектра перспективных малотоксичных фунгицидов и бактерицидов для борьбы с болезнями растений, а также апробация действия новых соединений на широко распространенных в природе возбудителях болезней [4].

В представленной работе приведены данные по синтезу новых 4-амино-3-алкоксиметилпиразолов с фенильным и 2-нафтильным заместителями. Известно, что различные производные аминопиразолов обладают сильным бактерицидным и фунгицидным действием [6, 7]. Это позволяет предполагать наличие бактерицидной и фунгицидной активности и у новых, не синтезированных ранее производных аминопиразолов. Изучено их влияние на рост бактериальных тест-культур – E. coli (Escherichia coli), Pseudomonas spp., S. aureus MSSA, S. aureus MRSA и грибов рода Trichoderma asperellum и Mucor hiemalis, что является не только актуальной научной задачей, но и необходимым условием разработки новых средств защиты растений.

Цель исследования

Изучение влияния производных 4-аминопиразолов с алкоксиметил и арильными заместителями на рост бактериальных тест-культур – E. coli, Pseudomonas spp., S. aureus MSSA, S. aureus MRSA и грибов рода Trichoderma asperellum и Mucor hiemalis.

Материалы и методы исследования

Объектом настоящего исследования стали 4-аминопиразолы, содержащие арильный и метильный или алкоксиметильный заместители. Соединения были синтезированы из нитрозопиразолов [2] по следующей схеме (рис. 1).

Аминопиразолы получали восстановлением нитрозопиразолов гидразингидратом на катализаторе палладий на угле концентрацией 0,7 % в дихлорметане. В результате выделяли белые кристаллические вещества, растворимые в этиловом спирте, диметилсульфоксиде и нерастворимые в воде.

Ход реакций и чистоту соединений контролировали методами тонкослойной хроматографии на пластинах Sorbfil марки ПТСХ-АФ-В (Россия) в системе «этилацетат-толуол» (1:3); пятна детектировали в ультрафиолетовом свете. Строение всех синтезированных соединений было доказано современными физико-химическими методами анализа [1, 3].

Исследования антибактериальной активности на тест-культурах E. coli, штамм ATСС 25822, чувствительный к антибиотикам, S. aureus MSSA (Staphylococcus aureus, штамм 209 Р, чувствительный золотистый стафилокок) и Staphylococcus аureus MRSA (Метициллин – резистентный стафилококк) для соединений 1–5 (см. рис. 1) проводились в лаборатории на кафедре микробиологии (Красноярский государственный медицинский университет им. профессора Войно-Ясенецкого) методом серийных разведений. Двукратное разведение соединений в объеме 1 мл готовили на дистиллированной воде. В каждую пробирку с растворенным 4-аминопиразолом вносили по 0,1 мл взвеси испытуемых тест-культур, приготовленных из 18-часовых агаровых культур по стандарту мутности 0,5 макфарланда. Пробирки инкубировали при 37 °С. Высев производили через 24 часа на сектора штрихом в чашки с мясопептонным агаром. Учет результатов производили по наличию и характеру роста культур на питательной среде. Концентрация 4-аминопиразолов составляла 10–12 мг/мл (5*10-2 моль/л).

Определение антибактериальной активности на тест-культуре Pseudomonas spp. для 3-метил-4-амино-5-(2-нафтил)-1-Н-пиразола проводили в микробиологической лаборатории кафедры химической технологии древесины и биотехнологии (Сибирский государственный аэрокосмический университет им. академика М.Ф. Решетнева). Двукратное разведение соединений в объеме 4 мл готовили в диметилформамиде (ДМФА) и дистиллированной воде. В каждую пробирку с растворенным 4-аминопиразолом вносили по 0,1 мл взвеси испытуемой тест-культуры, приготовленной из 18-часовых агаровых культур по стандарту мутности 0,5 макфарланда. Пробирки инкубировали при 33 °С в течение 24 часов. Концентрация изучаемого 4-аминопиразола составляла 35 мг/мл (16*10-2 моль/л).

Исследование антифунгальной активности соединений 1–5 проводили на грибах рода Trichoderma asperellum и Mucor hiemalis методом лунок в лаборатории микробиологии кафедры химической технологии древесины и биотехнологии (Сибирский государственный аэрокосмический университет им. академика М.Ф. Решетнева). В стерильные чашки Петри разливалась стерильная питательная среда «сусло-агар». После застывания на твердую агаровую пластинку делался посев тест-организма газоном. Чашки подсушивались в термостате при 37 °С в течение 15–20 минут. Далее в толще агаровой пластинки стерильным пробочным сверлом диаметром 10 мм делались лунки, вырезая агаровые блоки и удаляя из чашки с помощью стерильного скальпеля. В лунки пипеткой вносились различные концентрации раствора (7–150 мг/мл) аминопиразолов в диметилсульфоксиде (ДМСО) в количестве 0,2 мл. В качестве контроля использовался чистый ДМСО. Посевы инкубировали в термостате при температуре 30 °С в течение 7 суток с тремя повторениями. Степень антибиотической активности учитывали по диаметру зоны подавления роста тест-культуры в мм.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты исследования влияния новых производных 4-аминопиразолов на рост бактерий приведены в табл. 1.

Было установлено, что синтезированные соединения 1–5 обладают выраженным бактерицидным действием по отношению к тест-культуре E. coli, полностью подавляя её рост в пробирках с растворенным аминопиразолом. Высев тестируемых образцов из пробирок на питательную среду также подтвердил отсутствие роста тест-культуры.

При изучении влияния 3-этоксиметил-4-амино-5-(2-нафтил)-1-Н-пиразола (соединеие 3) и 3-этоксиметил-4-амино-5-фенил-1-Н-пиразола (соединение 5) на рост тест-культуры Pseudomonas spp выявлено, что через 24 ч инкубирования рост бактерий в пробирках с растворенным пиразолом концентрацией 0,54 мг/мл и выше визуально не наблюдался. С целью выяснения наличия бактерицидного действия синтезированных пиразолов из пробирок, содержащих исследуемое вещество с концентрациями более 0,54 мг/мл (от 0,54 до 35 мг/мл) производили высев на сектора штрихом в чашки с мясопептонным агаром. Результаты учитывали по наличию и характеру роста культур. Как показал эксперимент, при всех используемых концентрациях в чашках наблюдался рост тест-культуры. Следовательно, 3-этоксиметил-4-аминопиразолы с 2-нафтильным и фенильным заместителями в отношении тест-культуры Pseudomonas spp обладает только бактериостатическим действием.

Влияние 4-аминопиразолов с арильными и алкоксиметильными заместителями (соединения 1–5) на рост бактериальных культур S. aureus MSSA и S. aureus MRSA обнаружено не было.

Результаты эксперимента на антифунгальную активность 3-метил-4-амино-5-(2-нафтил)-1-Н-пиразола (соединение 1) и 3-этоксиметил-4-амино-5-(2-нафтил)-1-Н-пиразола (соединения 3) показали, что грибы рода Trichoderma asperellum резистентны к данным соединениям, поскольку зоны подавления роста гриба в чашках отсутствовали (рис. 2).

Рис. 2. Влияние аминопиразолов 1, 3 на рост грибов рода Trichoderma asperellum

В свою очередь, все новые 4-аминопиразолы в различных концентрациях оказали ярко выраженное ингибирующее действие на рост грибов рода Mucor hiemalis (рис. 3). Данные по исследованию антифунгальной активности синтезированных аминопиразолов сведены в табл. 2.

Выводы

В результате проведенных исследований была выявлена отчетливо выраженная бактерицидная активность новых производных 4-аминопиразолов с арильными и алкоксиметильными заместителями по отношению к тест-культуре Escherichia coli.

Показано, что по отношению к тест-культуре Pseudomonas spp новые производные 4-аминопиразолов в концентрации 0,54 мг/мл и выше обладают лишь бактериостатическим действием, а на рост бактерий S. aureus MSSA S. aureus MRSА влияния не оказывают.

Установлено, что все новые синтезированные производные 4-аминопиразолов не оказывают ингибирующего действия на грибы рода Trichoderma asperellum, но в то же время подавляют рост грибов рода Mucor hiemalis, причем наличие в молекуле алкоксигруппы увеличивает данное биологическое действие.